Probiotic potential and safety aspects of lactic acid bacteria isolated from kefir and kombucha

Recent scientific researches have revealed a growing and notorious interest in the consumption of products that are beneficial to health. From this perspective, probiotics have gained great visibility, as they are live microorganisms that, when ingested in enough numbers, bring benefits to the consumer's health. Beverages such as kefir and kombucha have a variety of microorganisms with probiotic potential. The consumption of these can promote human health, and consequently, have been the object of study. Thus, the aim of this study was to isolate, identify and characterize lactic acid bacteria (LAB) from kefir and kombucha with probiotic potential and to evaluate in vitro safety aspects. The isolation and characterization of microorganisms were carried out using Gram stain, presence of catalase and morphology tests. Afterwards, safety aspects were evaluated through the activity of gelatinase, DNAse, hemolysin enzymes and susceptibility to clinically used antimicrobials. Furthermore, the cytotoxicity assay was performed using the MTT method using VERO cell lines. The technological properties were verified through the antimicrobial activity against pathogenic microorganisms by the well diffusion method, determination of the antioxidant capacity by the 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) radical capture method and reaction to thiobarbituric acid (TBARS). To analyze the probiotic potential, analyzes of tolerance to conditions of the simulated gastrointestinal tract, tolerance to different acid categories and tolerance to bile salts were analyzed. According to the results obtained, of the eight (n=8) isolates formed belonging to the BAL group (A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 and KAC), five (n=5) showed cocci morphology (A1, A3, A4, A5, A6) and three (n=3) of bacilli (A2, A7, KAC). All isolates showed negative results for gelatinase, DNAse and hemolysin tests. For the antimicrobial susceptibility test, it was found that all isolates showed susceptibility to vancomycin, penicillin, meropenem and chloramphenicol. Regarding the evaluation of technological properties, five (n=5) isolates (A1, A2, A3, A7 and KAC) showed antimicrobial characteristics against all the microorganisms used. Five (n=5) isolates (A1, A4, A6, A7, KAC) showed homofermentative metabolism. With the DPPH and TBARS method, it was observed that all isolates showed antioxidant capacity. For the self-aggregation, coaggregation and hydrophobicity test, isolates A2 and KAC presented the highest percentages of these parameters. Thus, two (n=2) isolates (A2 and KAC) were selected to perform the tolerance tests to different concentrations of acids, bile salts and simulated gastrointestinal tract. Both isolates showed tolerance to gastrointestinal transit in a simulated way. For the cytotoxicity assay, the isolate A2 was used and after one hour of exposure, the bacterial suspension showed no cytotoxicity in the VERO cell lines. These results are promising, as the microorganisms under study showed desirable characteristics for future applications in food matrices.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESPesquisas científicas recentes têm revelado um crescente e notório interesse mundial pelo consumo de produtos benéficos à saúde. Nessa perspectiva, os probióticos têm ganhado uma grande visibilidade, por serem micro-organismos vivos que, ao serem ingeridos em quantidades adequadas, trazem benefícios à saúde do consumidor. Uma variedade de micro-organismos com potencial tecnológico e até mesmo probiótico, podem estar presentes em bebidas como o kefir e a kombucha. Assim, o consumo destes, pode favorecer a saúde humana, e consequentemente, têm sido objeto de estudo. Desta forma, objetivou-se no presente estudo caracterizar isolados de bactérias ácido-lácticas (BAL) oriundas de kefir e de kombucha, quanto aos aspectos de segurança in vitro, avaliar o potencial tecnológico e probiótico dos isolados. Foi realizada a caracterização dos isolados, com testes de coloração de Gram, presença de catalase e morfologia. Após, foi avaliado aspectos de segurança por meio da atividade das enzimas gelatinase, DNAse, hemolisina e susceptibilidade a antimicrobianos de uso clínico. As propriedades tecnológicas, foram verificadas por meio da atividade antimicrobiana frente a micro-organismos patogênicos pelo método de difusão em poços, produção de fermentação de glicose, determinação da capacidade antioxidante pelo método de captura do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e reação ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Para analisar o potencial probiótico foram realizadas análises de autoagregação, coagregação e hidrofobicidade, tolerância às condições do trato gastrointestinal simulada, tolerância a diferentes concentrações ácidas e tolerância aos sais biliares. Ainda, foi realizado ensaio de citotoxicidade empregando o método MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio], utilizando linhagens de células VERO. De acordo com os resultados obtidos, dos oito (n=8) isolados caracterizados pertencentes ao grupo de BAL (A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 e KAC), cinco (n=5) apresentam morfologia de cocos (A1, A3, A4, A5, A6) e três (n=3) de bacilos (A2, A7, KAC). Todos isolados apresentaram resultados negativos para os testes de gelatinase, DNAse e hemolisina. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, verificou-se que todos os isolados apresentaram suscetibilidade à vancomicina, penicilina, meropenem e cloranfenicol. Quanto a avaliação de propriedades tecnológicas, cinco (n=5) isolados (A1, A2, A3, A7 e KAC) apresentaram características antimicrobianas frente a todos os microorganismos utilizados. Cinco (n=5) isolados (A1, A4, A6, A7, KAC) apresentaram metabolismo homofermentativo. Com oo métodoo de DPPH e TBARS, foi observado que todos os isolados apresentaram capacidade antioxidante. Para o teste de autoagregação, coagregação e hidrofobicidade, os isolados A2 e KAC apresentaram os maiores percentuais destes parâmetros. Desta forma, dois (n=2) isolados (A2 e KAC) foram selecionados para realização dos testes de tolerância a diferentes concentrações ácidas, sais biliares e trato gastrointestinal simulado. Ambos isolados apresentaram tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada. Para o ensaio de citotoxicidade, o isolado A2 foi utilizado e após uma hora de exposição, a suspensão bacteriana não apresentou citotoxicidade nas linhagens de células VERO. Estes resultados são promissores, pois os micro-organismos em estudo apresentaram características desejáveis visando futuras aplicações em matrizes alimentares