Production and application of prebiotic galactooligosaccharide as functional foods : studies in vitro and in vivo

Resumo: A maioria dos estudos que envolvem prebióticos têm sido realizados comfrutooligossacarídeos (FOS) e galactooligossacarídeos (GOS) devido a segurança, estabilidade, propriedades sensoriais, resistência à digestão na parte superior do intestino e fermentabilidade no cólon, bem como suas capacidades em promover o crescimento das bactérias benéficas no trato gastrintestinal. Assim, esta pesquisa teve como objetivo estudar a produção e aplicação do prebiótico galactooligossacarídeo (GOS) em estudos in vitro e in vivo. A produção de GOS foi realizada utilizando a enzima ß-galactosidase, extraída de Scopulariopsis sp., na forma livre e imobilizada no suporte orgânico DEAE-celulose. Por meio do estudo in vitro avaliou-se o efeito do GOS sobre a produção de citocinas em culturas de células tumorais, utilizando interferon gama (INF-?) como marcador. Verificou-se também o efeito bifidogênico do GOS, utilizando as culturas probióticas Lactobacillus acidophillus (LA05) e Bifidobacterium animalis (Bb12), bem como a ação dos metabolitos, resultantes da fermentação por estes micro-organismos probióticos, em relação à atividade antiproliferativa em modelos de células tumorais. Foi realizado ainda o estudo in vivo com ratas adultas, com o objetivo de avaliar o impacto fisiológico dos prebióticos FOS e GOS no intestino (ceco) dos animais, através das análises de pH fecal e técnicas de morfometria intestinal. O rendimento da produção de GOS foi de 30% em 12 horas e 24% em 15 dias para a enzima livre e imobilizada, respectivamente. Nos estudos in vitro, a ação direta do GOS apresentou indícios de atividade antiproliferativa na linhagem HT-29 (adenocarcinoma de cólon), todavia, não foi capaz de reduzir em pelo menos 50% o crescimento das células tumorais. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre as células tumorais estudadas em relação à concentração de IFN-?. O efeito bifidogênico do GOS foi demonstrado pelas diferenças observadas entre as contagens iniciais e finais ( logUFC.mL-1) utilizando o meio MRS+GOS, que foram de 3,98 logUFC.mL-1 para LA05 e de 4,6 logUFC.mL-1 para Bb12. Os metabólitos resultantes da fermentação da linhagem LA05 foram testados quanto à atividade antiproliferativa em linhagens tumorais humanas. Verificou-se que o meio sem dextrose (MRS-mínimo) apresentou atividade antiproliferativa para as linhagens UACC-62 (melanoma), MCF-7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário), 786-0 (renal), NCI-H460 (pulmão) e HT-29 (cólon). O meio de cultura acrescido com GOS, por sua vez, apresentou efeito citostático apenas para duas linhagens (UACC-62 e HT-29). Os resultados obtidos sugerem que os metabólitos bacterianos provenientes da LA05 cultivada em meio sem GOS exercem efeito antiproliferativo e que o GOS reduz a produção desses compostos resultando em diminuição da atividade antiproliferativa. Quanto aos estudos in vivo, os animais que consumiram ração com os prebióticos tiveram um discreto aumento de peso, sem aumento no consumo de ração; além disso, não foi observado decréscimo relevante em relação ao pH do ceco. Os animais alimentados com FOS ou com GOS apresentaram aumento na altura das vilosidades intestinais em relação ao grupo controle (p<0.05). Foi verificado que apenas as vilosidades intestinais dos animais que consumiram FOS apresentavam-se mais largas, quando comparado com o grupo controle. Por outro lado, quanto à altura dos enterócitos, as ratas que consumiram GOS apresentaram média maior que o grupo padrão, enquanto as alimentadas com FOS não apresentaram diferença significativa (p<0,05). Embora os mecanismos envolvidos em relação à atividade metabólica do GOS não estejam totalmente esclarecidos, sugere-se que este oligossacarídeo tenha potencial de modulação no epitélio intestinal das células. Não é possível, no entanto, excluir o efeito mediado pelos ácidos graxos de cadeia curta, estimulados a partir da ingestão dos prebióticos, em relação à nutrição dos enterócitosAbstract: Most studies involving prebiotic have been performed with fructooligossacarídeos (FOS) and galactooligosaccharides (GOS), due to security, stability, sensory properties, resistance to digestion in the upper bowel and fermentability in the colon as well as their ability to promote beneficial bacteria growth in the gastrointestinal tract. Thus, the aim of this research was to study the prebiotic galactooligosaccharide (GOS) production and application in vitro and in vivo. GOS production was performed using ß-galactosidase enzyme extracted from Scopulariopsis sp. in free form and immobilized on an organic DEAE-cellulose. The in vitro study GOS effect on cytokine production was evaluated on human cancer cell lines, using interferon gamma (INF-?) as a marker. GOS bifidogenic effect was determined using probiotic cultures Lactobacillus acidophillus (LA05) and Bifidobacterium animalis (Bb12) and the antiproliferative activity of metabolites resulting from these probiotics microorganisms fermentation was studied in human cancer cell lines. An in vivo study was also performed with adult female rats in order to evaluate the physiological impact of prebiotics FOS and GOS in the cecum of animals by analyzing fecal pH and intestinal morphology was done. The yield of GOS production was 30% at 12 hours and 24% at 15 days for free and immobilized enzyme, respectively. The direct action of GOS in vitro showed evidence of antiproliferative activity in HT-29 line (colon adenocarcinoma), however, it was not able to reduce at least 50% growth of tumor cells. There was no significant difference (p> 0.05) between tumor cells studied in IFN-? concentration. GOS bifidogenic effect was demonstrated by differences between initial and final scores ( logUFC.mL-1) when MRS + GOS was used. The difference was 3,98 logUFC.mL-1 for LA05 and 4,6 logUFC.mL-1 for Bb12. The metabolites resulting from LA05 fermentation were tested for antiproliferative activity on human cancer cell lines. The medium without dextrose (MRS-minimum) showed antiproliferative activity for the cell lines UACC-62 (melanoma), MCF-7 (breast), NCI-ADR/RES (ovary), 786-0 (renal) NCI-H460 (lung) and HT-29 (colon). The culture medium supplemented with GOS, in turn, showed only a cytostatic effect for two cell lines (UACC-62 and HT-29). The results suggest that bacterial metabolites from LA05 grown in medium without GOS exert antiproliferative effect while GOS supplementation propably reduced the active metabolites concentration. Animals fed with diet supplemented by prebiotics showed slight weight gain with no changes in fed intake and no significant decrease on cecal pH. Animals fed with FOS or GOS showed an increase in villus height in comparison with control group (p <0.05). It was found that only the villi of the animals fed with FOS were wider when compared with control group. Moreover, the enterocytes height was larger in rats that consumed GOS in comparison of control group, while those fed with FOS did not differ significantly (p