Influence of myxobacterial compounds on the interaction of endothelial cells with cancer cells or leukocytes

In the recent years, myxobacteria have emerged as a novel source of natural compounds with structural diversity and biological activity for drug discovery. In this work, the two myxobacterial compounds archazolid and vioprolide were characterized for their potential pharmacological effects in vascular endothelial cells. Archazolid is a wellestablished v-ATPase inhibitor found in Archangium gephyra and Cystobacter spec. As the v-ATPase represents a promising target in cancer treatment, the effects of archazolid have been intensively studied in cancer cells, but rarely in endothelial cells. Vioprolide is an antifungal and cytotoxic metabolite obtained from Cystobacter violaceus. There are only few studies on vioprolide, most of them focusing on its biosynthesis. Preliminary studies revealed that it inhibited TNF-induced expression of ICAM-1, indicating possible anti-inflammatory properties. As the endothelium plays an important role in cancer and inflammation, it represents an attractive drug target. Therefore, the archazolid and vioprolide were investigated regarding their effects on endothelial cells. V-ATPase inhibition by archazolid resulted in anti-tumor and anti-metastatic effects in vitro and in vivo. Archazolid was used to study the consequences of v-ATPase inhibition in endothelial cells that might contribute to the anti-metastatic activities observed in vivo. To analyze the impact of archazolid on the interaction endothelial and cancer cells, in vitro cell adhesion and transmigration assays were performed using primary HUVEC or immortalized HMEC-1 and different cancer cell types (MDA-MB-231, PC-3 and Jurkat cells). For these experiments, only the endothelial cells were treated with archazolid. VATPase inhibition by archazolid led to an increased adhesion of the metastatic breast cancer cell line MDA-MB-231 and prostate cancer cell line PC-3 onto endothelial cells whereas the adhesion of Jurkat cells was unaffected. Interestingly, archazolid treatment of HUVECs decreased the transendothelial migration of MDA-MB-231 cells. Endothelial ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and N-cadherin are potential ligands of interacting cancer cells. Therefore, the mRNA and surface protein levels of these cell adhesion molecules were measured via qRT-PCR and flow cytometry, respectively. These adhesion molecules were not responsible for the archazolid-induced cancer cell adhesion, as archazolid treatment of HUVECs did not upregulate their mRNA or surface expression. Instead, cell adhesion assays using a monoclonal antibody against integrin subunit β1 showed that β1-integrins expressed on MDA-MB-231 and PC-3 cells mediated the archazolid-induced cancer cell adhesion. Cell adhesion assays onto plastic coated with ECM components which are the major ligands of β1-integrins, revealed that MDA-MB231 and PC-3 cells preferably interact with collagen. So next, we investigated the influence of archazolid on surface collagen levels in HUVECs by immunostaining, which demonstrated an increase of nearly 50 % upon archazolid treatment. We confirmed the hypothesis that the expression and activity of cathepsin B, a lysosomal enzyme that degrades extracellular matrix components including collagen, was inhibited by archazolid in endothelial cells. Finally, overexpression of cathepsin B reduced the cancer cell adhesion on archazolid-treated HUVECs, but also in control cells, indicating a negative correlation between cathepsin B expression and cancer cell adhesion. The influence of vioprolide on the interaction of endothelial cells with leukocytes was analyzed by in vitro cell adhesion assays using HUVECs and primary monocytes, THP-1 or Jurkat cells. Vioprolide inhibited the adhesion of these cells onto TNF-activated HUVECs. In addition, the endothelial-leukocyte interaction was observed in vivo by intravital microscopy in the mouse cremaster muscle. Vioprolide prevented the TNFinduced firm adhesion and transmigration of leukocytes, while leukocyte rolling was not affected. ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin are cell adhesion molecules, which are upregulated by TNF and mediate leukocyte adhesion onto endothelial cells. Therefore, flow cytometric analysis was performed to measure their surface expression. Vioprolide significantly decreased TNF-induced expression of surface ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin, which was in line with the in vitro results. In vivo, vioprolide may act in a different way on E-selectin expression, so that leukocyte rolling, which is governed by E-selectin, remained unaffected. qRT-PCR experiments revealed that the mRNA expression of ICAM-1 and VCAM-1 were also reduced by vioprolide, indicating a regulation on transcriptional level. In contrast, the mRNA expression of E-selectin was not decreased at the timepoint when surface protein expression was diminished. The induction of these cell adhesion molecules is mainly mediated by the transcription factor NFκB. A Dual-Luciferase® reporter assay was used to study the impact of vioprolide on the TNF-induced NFκB promotor activity. Vioprolide blocked the TNF-induced NFκB promotor activity while the TNF-induced IκBα degradation and nuclear translocation of the NFκB subunit p65 was not altered by vioprolide. Western blot analysis revealed that vioprolide had no effect on the activation of MAPK (p38, JNK) and AKT by TNF, which could interfere with the NFκB-dependent gene expression. Taken together, archazolid and vioprolide are interesting myxobacterial compounds with different modes of actions. The study suggests that the v-ATPase inhibitor archazolid impairs the expression and activity of cathepsin B in endothelial cells, which leads to a higher amount of collagen on the endothelial surface. As a result, the adhesion of β1-integrin expressing metastatic cancer cells onto archazolid-treated endothelial cells increased while transendothelial migration was reduced. Further, archazolid represents a promising tool to elucidate the role of v-ATPase in endothelial cells. Vioprolide was able to prevent TNF-induced endothelial-leukocyte interaction in vitro and in vivo by interfering with NFκB-dependent gene expression. Further research is required to enlighten the underlying mechanism and the direct target of vioprolide.Das vaskuläre Endothel kleidet die innere Oberfläche des kardiovaskulären Systems aus und besteht aus einer einzigen, dünnen Schicht von Endothelzellen. Es spielt nicht nur eine Rolle als selektive Barriere für niedermolekulare Substanzen, Makromoleküle und Zellen, sondern reguliert auch aktiv homöostatische und pathologische Prozesse, einschließlich des Gefäßtonus, der Koagulation, der Wundheilung und der akuten Entzündung. Chronische Entzündungen stehen im Zusammenhang mit einer Vielzahl an Krankheiten, wie z.B. Atherosklerose, Allergien, kardiovaskuläre Erkrankungen, Diabetes, neurodegenerative Erkrankungen und Adipositas. Das Endothel spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Tumor-Metastasen. Der primäre Tumor wird von den umgebenden Endothelzellen mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt. Gleichzeitig stellt das Endothel an dieser Stelle die Eintrittsfläche für die Intravasation von Krebszellen in den Blutkreislauf dar. Da das Endothel eine wichtige Rolle bei Entzündungs- und Metastasierungsprozessen spielt, stellt es ein attraktives Wirkstoffziel dar. Naturstoffe zeigen durch die Evolution eine einzigartige chemische Diversität und sind somit eine wertvolle Quelle für die Arzneimittelentwicklung. In den letzten Jahren, haben sich Myxobakterien als neue Quelle für Naturstoffe für die Wirkstoffforschung etabliert. In ihrer natürlichen Umgebung produzieren Myxobakterien Enzyme, um biologische Makromoleküle, Zellbestandteile oder ganze Zellen zu verdauen, und Antibiotika, die sie vor anderen Mikroorganismen schützen. Diese Sekundärmetabolite weisen eine hohe strukturelle Diversität und biologische Aktivität auf. In dieser Arbeit wurden die Wirkungen der zwei myxobakteriellen Naturstoffe Archazolid und Vioprolid auf Endothelzellen, insbesondere auf die Interaktion von Endothelzellen mit Krebszellen bzw. Leukozyten, charakterisiert. Archazolid ist ein etablierter Inhibitor der v-ATPase, der erstmals aus Archangium gephyra isoliert wurde. Die v-ATPase ist die wichtigste Protonenpumpe, die den pH-Wert in eukaryotischen Zellen reguliert. Sie wird hauptsächlich im Endomembransystem exprimiert und sorgt für das saure Milieu in intrazellulären Kompartimenten, wie z.B. der Lysosomen, der Endosomen, des Golgi-Apparates und der sekretorischen und beschichteten Vesikel. Der saure pH-Wert ist für viele zelluläre Prozesse notwendig, wie z.B. den Membrantransport, die Rezeptor-vermittelte Endocytose und die Prozessierung und Degradation von Proteinen. Krebszellen exprimieren die v-ATPase auf ihrer Zelloberfläche, um toxische intrazelluläre H+-Ionen in den Extrazellulärraum zu pumpen. Das saure Milieu der Tumorumgebung aktiviert Proteasen, die die Degradation der extrazellulären Matrix und somit den Metastasen fördern, die der Hauptgrund für die Mortalität durch Krebs sind. Die v-ATPase ist eine vielversprechende Zielstruktur für die Krebstherapie, da bereits gezeigt wurde dass die Inhibierung dieser Protonenpumpe die Invasivität von Krebszellen sowie die Bildung von Metastasen vermindert. Archazolid kann einerseits als Leitstruktur für die Arzneimittelentwicklung dienen, als auch als chemisches Werkzeug genutzt werden um die Auswirkungen der Inhibition der v-ATPase zu untersuchen. In Krebszellen wurde die Rolle der v-ATPase schon intensiv untersucht. Die Inhibition der v-ATPase durch Archazolid führt sowohl in vitro als auch in vivo zu anti-tumoralen und anti-metastatischen Effekten. Archazolid hemmte die Migration von SKBR-3-Brustkrebszellen, reduzierte das Wachstum und induzierte Apoptose in Brustkrebs- und Leukämiezellen und verminderte proliferative Signalwege in Leberkrebszellen. Zudem wurde die Metastasierung von injizierten 4T1-Luc-Zellen in die Lungen von Mäusen durch Archazolid signifikant reduziert. In Endothelzellen dagegen wurde Rolle der v-ATPase noch kaum analysiert. Die v-ATPase reguliert die Migration von Endothelzellen und Signalwege, die wichtig für die Angiogenese sind. Archazolid wurde verwendet um die Konsequenzen einer Inhibition der v-ATPase in Endothelzellen zu untersuchen, die möglicherweise zu den anti-metastatischen Effekten beitragen könnten, die in vivo beobachtet wurden. Um den Einfluss von Archazolid auf die Interaktion von Endothelzellen und Krebszellen zu analysieren, wurden in vitro Zelladhäsions- und Transmigrationsassays mit primären HUVEC oder immortalisierten HMEC-1 und verschiedenen Krebszelltypen (MDA-MB-231-, PC-3- oder Jurkatzellen) durchgeführt. Für diese Experimente wurden jeweils nur die Endothelzellen mit Archazolid behandelt. Die Inhibition der v-ATPase durch Archazolid bewirkte eine Steigerung der Adhäsion der metastatischen MDA-MB-231-Brustkrebszellen und PC-3-Prostatakrebszellen auf Endothelzellen, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Adhäsion von Jurkatzellen. Interessanterweise wurde die transendotheliale Transmigration von MDA-MB-231-Zellen durch Archazolid verringert. Die genauen Mechanismen für die Adhäsion und Transmigration von Krebszellen ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Jedoch wird vermutet, dass die Vorgänge für Krebszellen und Leukozyten ähnlich sind. Studien zeigten, dass ICAM-1, VCAM-1, ESelektin und N-Cadherin auf dem Endothel potentielle Liganden von interagierenden Krebszellen sind und entweder am Rollen, an der festen Adhäsion oder an der Transmigration beteiligt sind. Daher wurde sowohl die mRNA als auch die Oberflächenexpression dieser Zelladhäsionsmoleküle mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und Durchflusszytrometrie in Archazolidbehandelten HUVECs gemessen. Keiner dieser Zelladhäsionmoleküle wurde durch Archazolid hochreguliert, somit waren sie nicht für die erhöhte Adhäsion der MDA-MB231- und PC-3-Zellen verantwortlich..