Imunossensores de fibra ótica baseados em SPR para a deteção de cortisol

Stress is a normal physiological and behavioral response to a stimulus that somehow disturbs the maintenance of homeostasis, leading to changes in cortisol (stress hormone) levels. When stress is persistent and uncontrolled, it can severely affect several areas, such as human health and some applications in marine biology, including aquaculture production. Currently, the detection of cortisol is performed in laboratories using conventional techniques which have several disadvantages, one of them being the long waiting time for a response. Therefore, it is essential to develop biosensors that detect cortisol directly in point of care (POC). Biosensors are miniaturized analytical devices capable of detecting and quantifying specific biomarkers. In addition, they allow real-time monitoring, overcoming the disadvantages of conventional techniques. Silica optical fibers (SOF) and polymeric optical fibers (POF) coated with gold (Au) were used in this work to develop immunosensors for cortisol detection. Throughout the entire experimental process, simulation of the response to the refractive index (RI) of the optical fibers coated with Au was also carried out to compare the experimental results with those obtained from the simulation. In the laboratory, Au-coated fibers were initially characterized at RI with eight glucose concentrations ranging from 1.333 to 1.386 RI units (RIU). The obtained sensitivity with Au-SOF was 1646.67 ± 91.66 nm/RIU, being lower than the simulated (2138.95 ± 142.65 nm/RIU), and for Au-POF the sensitivity presented a value of 1566.81 ± 96.87 nm/RIU, was not possible to obtain results by the simulation. Subsequently, the fibers were functionalized with anti-cortisol antibody (AB) and passivated with bovine serum albumin (BSA), using cysteamine which has a thiol group and an amine group to allow binding to Au and AB, respectively. After this procedure, both immunosensors were tested for a range of cortisol concentrations from 0.01 to 100 ng/ml, in which the SOF immunosensors had a mean total resonance wavelength shift of 3.70 ± 0.39 nm, and a limit of detection (LOD) of 1.46 ng/mL, whereas for POF immunosensors it was not possible to trace a calibration line. Control tests on sensors functionalized with anti-cortisol AB were also performed using glucose (50 mg/dL and 500 mg/dL) and cholesterol (170 mg/dL and 240 mg/dL). The functionalization and detection test of immunosensors were accompanied by morphological and chemical characterization. Finally, a preliminary test of a SOF immunosensor regeneration showed promising results. In the future, it will be necessary to perform regeneration and reuse tests to validate the applied procedure.O stress é uma resposta fisiológica e comportamental normal a um estímulo que, de alguma forma, perturba a manutenção da homeostase, levando à alteração dos níveis de cortisol (hormona do stress). Quando o stress é perseverante e descontrolado pode afetar gravemente várias áreas, como a saúde humana e algumas aplicações na biologia marinha, incluindo a produção de aquacultura. Atualmente, a deteção de cortisol é realizada em laboratórios por técnicas convencionais que apresentam várias desvantagens, sendo uma delas o elevado tempo de espera pela resposta. Deste modo, é imprescindível o desenvolvimento de biossensores que detetem o cortisol diretamente no local de interesse (POC, do inglês point of care). Os biossensores são dispositivos analíticos miniaturizados capazes de detetar e quantificar biomarcadores específicos. Ademais, permitem a monitorização em tempo real superando as desvantagens das técnicas convencionais. Fibras ótica de sílica (SOF, do inglês silica optical fibers) e fibras ótica poliméricas (POF, do inglês polymeric optical fibers) revestidas com ouro (Au) foram utilizadas neste trabalho para desenvolver imunossensores para a deteção de cortisol. Ao longo de todo o processo experimental, foi também efetuada a simulação da resposta ao índice de refração (RI, do inglês refractive index) das fibras óticas revestidas com Au de forma a poder comparar os resultados experimentais com os obtidos a partir da simulação. Em laboratório, as fibras revestidas com Au foram inicialmente caracterizadas ao RI com oito concentrações de glicose com RI de 1,333 a 1,386 unidades de RI (RIU, do inglês refractive index unit). A sensibilidade obtida com a Au-SOF foi 1646,67 ± 91,66 nm/RIU, sendo inferior à simulada (2138,95 ± 142,65 nm/RIU), e para a Au-POF a sensibilidade apresentou um valor de 1566,81 ± 96,87 nm/RIU, não sendo possível obter resultados pela simulação. Posteriormente, as fibras foram funcionalizadas com o anticorpo (AB, do inglês antibody) anti-cortisol e passivadas com albumina do soro bovino (BSA, do inglês bovine serum albumin), utilizando a cisteamina que apresenta um grupo tiol e um grupo amina para permitir a ligação ao Au e ao AB, respetivamente. Após este procedimento, ambos os imunossensores foram testados para uma gama de concentrações de cortisol de 0,01 a 100 ng/mL, no qual os imunossensores de SOF apresentaram um desvio total médio do comprimento de onda de ressonância de 3,70 ± 0,39 nm e um limite de deteção (LOD, do inglês limit of detection) de 1,46 ng/mL, enquanto que para os imunossensores de POF não foi possível traçar uma reta de calibração. Testes de controlo em sensores funcionalizados com AB anti-cortisol foram também realizados utilizando glicose (50 mg/dL e 500 mg/dL) e colesterol (170 mg/dL e 240 mg/dL). A funcionalização e o teste de deteção dos imunossensores foram acompanhados de caraterização morfológica e química. No final, um teste preliminar de regeneração de um imunossensor de SOF mostrou resultados promissores. Futuramente, será necessário realizar ensaios de regeneração e reutilização para validação do procedimento aplicado.Mestrado em Engenharia Biomédic