Microbiota profiling: Forensic applications

Over the last three decades, studies unveiled the great diversity of viruses, archaea; bacteria and fungi occupying body sites and our surrounding environment. The advent of Next-Generation 5equencing (NG5) enabled large-scale metagenomics studies to describe the microbial composition of these niches. The presence of specific microbial strains or their combination in our oral, gut, skin or respiratory microbiota were associated to health and diseases. These observations opened new horizons in clinical microbiology, where microbiota profiling couId contribute to the care of chronic· disease such as cancer or metabolic syndrome. The potential of NG5-based assays was also seen for forensic applications. The field of forensic microbiology first applied NG5 for typing and phylogeny­ based source-tracking of bioterrorism agents. Then, the profiling of microbiota composition in samples collected on crime scenes or from cadavers was proposed as a source of intelligence to support forensic investigations. ln this thesis, we investigated the applicability of microbiota analysis by 165 rRNA metagenomics to forensic applications. To this aim, we optimized and validated protocols for microbiota profiling. The knowledge gained and the workflows established within this framework benefited to microbiota projects outside forensics. A fundamental limitation of metagenomics is the huge impact of technical parameters on the results. Combined to a lack of standards, this source of result inconsistency limits the transfer of microbiota profiling to routine applications. ln a narrative review, we described the potential of metagenomics to measure clinical biomarkers, but also standing challenges in the field. To overcome these hurdles, our review proposes a quality management scheme adapted to the specificities of biomarker measurements by metagenomics. According to these limitations, our own 165 rRNA metagenomics workflows was optimized and validate. The results of these experiments contributed to the IS015189 accreditation of our laboratory and are described in a dedicated manuscript. Then, microbiota profiling was used to investigate two applications in forensic sciences. Drowning is assumed when a cadaver is found immerged in water but must be confirmed by a medico­ legal investigation. Drowning diagnosis is complex and should rely on paraclinical assay results and clinical signs that have suboptimal sensitivities and specificities. The identification of water-borne bacteria was proposed as a complementary assay to assert if cardiovascular circulation was active at the moment of water entry into the lungs. We assessed the applicability of water-borne bacteria detection in organs for the diagnosis of drowning in a series of 8 cases analyzed on request from the · prosecutor. This project confirmed the interest, but also the complexity of microbiota-based investigation for the diagnos·is of drowning. Saliva traces are frequently recovered from crime scenes and on victims of sexual assaults. Saliva hasts a rich, diverse, and relatively stable microbiota. To complement standard assays, it was thus proposed to use the description of its composition by metagenomics to identify individuals. This approach was tested by analyzing saliva samples collected longitudinally from 30 pairs of monozygotic twins. This project confirmed that salivary microbiota-based identification remains possible even when samples were collected months apart or from a mock trace evidence. Altogether, our work explored some interesting applications of 16S rRNA metagenomics in forensic setting, but also highlighted their complexity. The optimization and validation of workflows enabled our laboratory to comply ta' 15015189 requirements. The knowledge gained by working on forensic casè scenario couId be applied to diverse research projects and shared through research collaboration as well as courses to our local community of researcher and clinicians. -- Notre corps et notre environnement sont habités par une grande diversité de virus, archées, bactéries et champignons. Le développement du séquençage à haut débit a permis de décrire la composition microbienne de ces niches. La présence de microbes spécifiques ou leur combinaison dans nos microbiotes ont été associées à notre état de santé. L'analyse et la modulation du microbiote ont le potentiel d'améliorer le traitement de maladies chroniques tel que les cancers ou le syndrome métabolique. Le domaine des sciences criminelles s'est aussi intéressé au séquençage à haut débit, notamment pour attribuer une origine aux agents de bioterrorisme par typage ou par analyse phylogénétique. La description du microbiote d'échantillons collectés sur des scènes de crimes ou de cadavres a aussi été proposé comme source d'informations dans les investigations judiciaires. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l'application_ de l'analyse de microbiote par métagénomique 16S ARNr dans le cadre d'investigations forensiques. Pour ceci, nous avons optimisé et validé des protocoles d'analyse du microbiote. Ces développements ont également été mis à contribution pour divers projets d'analyse du microbiote hors du domaine forensique. Une limite fondamentale de la métagénomique est la dépendance entre paramètres techniques utilisés et les résultats. En l'absence de standards établis, cette variabilité limite le transfert de la métagénomique vers des applications pratiques de routine. Dans le cadre d'une revue narrative, nous décrivons le potentiel ainsi que les limites actuelles de l'usage clinique de la métagénomique. Grâce à ces observations, nous proposons un plan d'assurance qualité adapté aux spécificités des analyses de biomarqueurs cliniques par métagénomique. Nous avons appliqué ces principes pour optimiser et valider notre propre protocole d'analyse par métagénomique 16S ARNr. Les résultats de ces expériences de validation, ont permis à notre laboratoire d'obtenir une accréditation 1S015189. La métagénomique 16S ARNr a ensuite été appliquée dans le contexte forensique. La mort par noyade est présumée lorsque qu'un corps est retrouvé inerte dans l'eau. Ce diagnostic doit toutefois être confirmé par une investigation médico-légale basée sur des observations cliniques et paracliniques, dont l'interprétation reste complexe et incertaine. La détection de bactéries aquatiques dans les organes internes (foie, rate) pourrait témoigner d'une circulation cardio-vasculaire active au moment de l'entrée d'eau dans les poumons. Nous explorons cette approche dans une série de 8 cas soumis pour analyse par un procureur. Nos observations montrent l'intérêt, mais aussi la difficulté de mener une telle analyse. Des traces de salives sont fréquemment retrouvées sur des scènes de crimes et sur les victimes d'agressions sexuelles. La composition du microbiote salivaire a été décrite comme étant relativement propre à chaque individu et stable dans le temps. Il a été proposé d'utiliser sa composition comme empreinte pour l'identification de personnes à partir de trace. Nous avons testé cette approche sur une cohorte de 30 paires de jumeaux monozygotes. Nos résultats confirment la possibilité d'identifier un individu à partir du microbiote salivaire. Cette identification reste possible même lorsque les échantillons de salive sont collectés après des mois, ou à partir d'une trace sur une surface. Dans l'ensemble, notre travail confirme l'intérêt, mais aussi la difficulté de mener à bien des analyses du microbiote par métagénomique 16S ARNr dans le contexte d'investigations criminelles ou médico­ légales. La mise au point et la validation de nos protocoles a permis d'obtenir une accréditation 15015189. Finalement, les développements réalisés dans l'optique d'applications forensiques nous ont permis de constituer un bagage de connaissance qui peut être partagé avec des chercheurs et des cliniciens dans le cadre de collaborations et de cours. -- Notre corps et notre environnement sont habités par une grande diversité de microorganismes. La peau, les intestins et la salive notamment accueillent un ensemble de virus, bactéries, archées et champignons qui forment le microbiote. La composition du microbiote est étudiée grâce au séquençage qui permet de lire les séquences de I' ADN. Dans ce travail, nous avons utilisé une approche spécifique du séquençage, la métagénomique, où tout I'ADN d'un échantillon est extrait puis, une partie appelée 16S est séquencée. En effet, l1ADN de toutes les bactéries contient une séquence, le 16S ARNr, qui une fois lu par séquençage peut être utilisé comme un code-barre pour les reconnaître. Bien qu1utilisée par les chercheurs depuis des décennies, cette méthode reste difficilement applicable en routine. Nous avons donc fait une revue de littérature afin de déterminer le potentiel, mais aussi les limitations de la métagénomique. Appliquées à nos propres protocoles, les conclusions de cette revue nous ont permis d'optimiser et valider nos analyses. Un lien entre la composition du microbiote et l'état de santé a été montré, associant notamment la présence de certaines bactéries avec des maladies comme les cancers ou 11obésité. Ces études ont également montré que la composition du microbiote est influencée par la génétique et l'environnement, le rendant propre à un individu. Basé sur cette observation, nous avons étudié s1il était possible de différencier deux individus grâce à leur microbiote. Pour ce projet en collaboration avec les sciences forensiques, nous avons analysé le microbiote salivaire de 30 paires de jumeaux monozygotes, des personnes avec la même génétique et ayant partagé le même environnement durant l1enfance. Nous avons montré que le microbiote de chacun formait comme une « empreinte » distinguable de celle de son jumeau, restant stable dans le temps. Nous avons aussi montré que cette « empreinte », lorsque déposée sur une surface, pouvait être identifiée avec succès. Dans une collaboration avec la médecine légale, nous avons utilisé l1analyse des bactéries dans les organes internes de cadavre pour affirmer ou contester la mort par noyade comme cause de décès. Dans le cas d1une noyade, le système cardio-vasculaire étant fonctionnel au moment où l'eau entre dans les poumons, les bactéries présentent dans l1eau vont entrer dans la circulation sanguine et coloniser les organes internes. Nous avons comparé les bactéries d'eau récupérée sur le lieu présumé de la noyade et celles des organes internes. Par comparaison, cette approche nous a permis d1estimer si.la personne s'était noyée ou si elle était déjà morte au moment où son corps a été immergé. Nos observations montrent le potentiel mais aussi la difficulté de mener une telle analyse. Notre travail montre l'intérêt de l'analyse du microbiote en utilisant la technique métagénomique basée sur le 16S ARNr pour des applications de sciences forensiques. Au travers de collaborations avec des cliniciens et des chercheurs, nous avons également pu utiliser nos connaissances pour étudier les bactéries notamment chez les patients atteints de mucoviscidose. La demande croissante de ce type d1analyse dans un grand nombre de domaines nous a amené à partager nos connaissances par le biais de cours dispensés à nos collègues chercheurs et cliniciens