Hexokinase et glucokinases chez la levure pathogène Candida albicans : implication dans la physiologie et la virulence

The pathogenic yeast Candida albicans is both a powerful commensal and pathogen of humans that can infect a wide range of organs and body sites. Metabolic flexibility promotes infection and commensal colonization by this opportunistic pathogen. Yeast cell survival depends upon assimilation of fermentable and non-fermentable locally available carbon sources. Physiologically relevant sugars like glucose and fructose are present at low level in host niches. However, because glucose is the preferred substrate for energy and biosynthesis of structural components, its efficient detection and metabolism are fundamental for the metabolic adaptation of the pathogen. We explored and characterized the C. albicans hexose kinase system composed of one hexokinase (CaHxk2) and two glucokinases (CaGlk1 and CaGlk4). Using a set of mutant strains, we found that hexose phosphorylation is mostly performed by CaHxk2, which sustains growth on hexoses. Our data on hexokinase and glucokinase expression point out an absence of cross regulation mechanisms at the transcription level and different regulatory pathways. In the presence of glucose, CaHxk2 migrates in the nucleus and contributes to the glucose repression signaling pathway. In addition, CaHxk2 participates in oxidative, osmotic and cell wall stress responses, while glucokinases are overexpressed under hypoxia. Hexose phosphorylation is a key step necessary for filamentation that is affected in the hexokinase mutant. Virulence of this mutant is clearly impacted in the Galleria mellonella and macrophage models. Filamentation, glucose phosphorylation and stress response defects of the hexokinase mutant prevent host killing by C. albicans. By contributing to metabolic flexibility, stress response and morphogenesis, hexose kinase enzymes play an essential role in the virulence of C. albicans. In a second time, we explored the regulatory role of hexokinase 2 involved in glucose signalling, a regulatory pathway developed by microorganisms to promote the use of glucose. In C. albicans, the glucose repression system has been maintained overall, but the role of the various actors and more particularly of hexokinase 2 has never been specified. Our work showed that in the presence of glucose, hexokinase 2, CaHxk2, is relocated in the nucleus and negatively regulates the expression of alternative carbon metabolism genes.�� Targeted deletion experiments have shown that the catalytic function of hexokinase 2 is required to enable the enzyme to perform its regulatory function. In parallel, we conducted a transcriptomic study by digital droplet PCR, as part of a technical project focused on the analysis of the transcription of metabolic genes during the very early phases of phagocytosis. Our work revealed a strong induction of genes belonging to alternative carbon metabolism pathways (ß-oxidation, neoglucogenesis, glyoxylic cycle)La levure Candida albicans, constituant de la microflore pathogène et commensale de l’homme colonise et infecte de nombreux organes. Cette colonisation est permise par la flexibilité métabolique de ce pathogène, dont la survie dépend de l’assimilation de sources carbonées fermentescibles ou non, localement disponibles. Parmi ces ressources, le glucose est présent en faible quantité dans certains sites du corps humain. Cette source de carbone étant préférentiellement utilisée par les microorganismes, sa détection et sa métabolisation optimales sont de première importance pour la survie du pathogène. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont été focalisés sur la première étape irréversible de la glycolyse, la conversion du glucose en glucose-6-phosphate par les hexoses kinases, jamais décrites chez C. albicans. Le système des hexose kinases chez C. albicans est constitué d’une hexokinase (CaHxk2) et de deux glucokinases (CaGlk1 et CaGlk4). La construction de différentes combinaisons de mutants de délétion, nous a permis de constater que la phosphorylation des hexoses était principalement assurée par l’hexokinase 2. L’analyse de l’expression des gènes codant pour l’hexokinase et les glucokinases a révélé une absence de régulation transcriptionnelle croisée et des mécanismes de régulation différents. Tandis que l’hexokinase est impliquée dans les réponses aux stress oxydant, osmotique et de paroi, les glucokinases sont surexprimées en condition hypoxiques. La phosphorylation des hexoses est une étape clé nécessaire à la transition filamenteuse qui est affectée chez le mutant hexokinase. L’analyse de la virulence des mutants de délétion conduite dans deux pathosystèmes différents (le modèle insecte Galleria mellonella et le modèle macrophage de souris (J774)), a révélé l’hypovirulence du mutant hexokinase 2, alors que la délétion des glucokinases ne conduit à aucun phénotype remarquable, posant la question du rôle physiologique de ces enzymes.Nos travaux ont ensuite exploré le rôle régulateur de l’hexokinase 2 impliquée dans la signalisation glucose, voie de régulation élaborée par les microorganismes pour privilégier l’utilisation du glucose. Chez C. albicans, le système de répression glucose a été globalement conservé mais le rôle des différents acteurs et plus particulièrement de l’hexokinase 2 n’a jamais été précisé. Nos travaux ont permis de démontrer qu’en présence de glucose, l’hexokinase 2, CaHxk2, est relocalisée dans le noyau et régule négativement l’expression des gènes du métabolisme carboné alternatif. Des expériences de délétion ciblées ont permis de mettre en évidence que la fonction catalytique de l’hexokinase 2 était requise pour permettre à l’enzyme d’exercer sa fonction régulatrice. Parallèlement nous avons mené une étude de transcriptomique par digital droplet PCR, dans le cadre d’un projet technique ciblé sur l’analyse de la transcription des gènes du métabolisme, au cours des phases très précoces de la phagocytose par les macrophages. Nos travaux ont mis en évidence une induction forte des gènes appartenant aux voies du métabolisme carboné alternatif (ß-oxydation, néoglucogenèse, cycle glyoxylique