Determination of behavioral changes and neuroinflammatory mechanisms in neurodevelopmental model of schizophrenia induced immune challenge in mice neonates

Schizophrenia is a major mental disorder. This disorder can impair thought processes, volition, perception, affect and social interaction. The causes of schizophrenia are still unknown, ranging from genetic influences, environmental factors, and dysfunction of brain areas, pathophysiological alterations and neurodevelopmental impairments. This work aims to determine the behavioral and neuroinflammatory changes in a neurodevelopment model of schizophrenia induced by neonatal immune challenge induced by Poly I:C in rats. For this, Wistar rats of both sex in the periods of 5-7 days (neonates), 35 days (adolescents), 60 days (young adults) and 74 days (adulthood) were used. To determine the preventive and theraputical effects of Clozapine, this antipsychotic was administered to adolescent and adult rats, respectively. The behavioral data was presented as mean ± standard error of the mean (SEM) and analyzed by two-way ANOVA followed by Bonferroni test as post-hoc test. The Y-maze test, in turn, was analyzed by one-way ANOVA followed by Student Newman Keuls. Values were considered significant when p <0.05. The results showed that the administration of Poly I: C at a dose of 2.0 mg/kg to neonates from 5-7 post natal days was able to induce schizophrenia as observed in young adults and adulthood by decreases in the pencentage of prepulse inhibition (PPI) of the startle reflex. These animals also presented working memory deficits noticed by increases in the number of error displayed in the Y maze test. Adolescent poly I:C treated animals did not present significant behavioral alterations as compared to adult poly I:C animals. Evaluation of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by immunohistochemical technique in rat brain tissues (PFC, hippocampus and striatum), showed an intense diffuse staining of iNOS in the tissues of the PFC and the striatum and a strong to moderate staining in the hippocampus of poly I:C adult animals when compared to the adult control group. However, a light staining was observed in adolescent animals when compared to other groups. There were differences in the intensity of staining between adolescent and adult Poly I: C animals, where the adult group showed higher intensity staining. Treatment with clozapine, in turn, decreased the staining of iNOS in some areas such as the hippocampus and PFC, being less evident in other as the striatum. These different results regarding the intensity of immunohistochemical stainning can be explained by the difference of dopaminergic receptors of the brain tissues studied. It is believed that these systems are modulated by nitric oxide. The evaluation by immunofluorescence for Iba-1 (a microglia marker) in the brain areas investigated, particularly in the hippocampus showed a decrease in the presence of ramifications and processes in the microglial cells from adult rats exposed to Poly I: C. In addition, the microglial cell bodies of the poly I:C adult rats were enlarged when compared to control adult animals, therefore indicating that adult poly I:C presented a higher microglial activation. In adolescent animals this activation was shown to be mild to moderate. Taken together, the current results showed, for the first time, an activation of microglial cells in adult animals submmited to the neonatal immune challenge accompanied by increases in iNOS staining. In addition, the atypical antipsychotic clozapine was able to revert poly I:C induced alterations indicating iNOS as a possible novel target for clozapine action.A esquizofrenia é um grave transtorno mental. Este transtorno é capaz de comprometer o pensamento, vontade própria, percepção, afeito, e a interação social. As causas da esquizofrenia são ainda desconhecidas, variando desde influências genéticas, fatores ambientais, disfunções de áreas cerebrais, alterações fisiopatológicas e comprometimentos neurodesenvolvimentais. Este trabalho tem como principal objetivo determinar as alterações comportamentais e neuroinflamatórias no modelo neurodesenvolvimental de esquizofrenia induzida por desafio imune neonatal provocado por Poly I:C em ratos. Foram utilizados desde o nascimento ratos Wistar neonatos de ambos os sexos, nos seguintes períodos 5-7 dias (neonatos), 35 dias (adolescentes), 60 dias (adultos jovens) e 74 dias (adultos). Para a determinação dos efeitos preventivos ou terapêuticos da clozapina os animais foram tratados com o antipsicótico atípico na adolescência ou idade adulta, respectivamente. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Os dados comportamentais foram analisados por two-way ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni como teste post-hoc. Os resultados do teste de Y-maze foram analisados por Two-way ANOVA no caso da avaliação de animais adolescentes e adultos seguido do teste de Bonferroni ou por One-way ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls no caso das avaliações dos animais na mesma idade. Valores significativos foram considerados quando p< 0,05. Os resultados mostraram que a administração intraperitoneal de Poly I:C 2,0 mg/kg em ratos Wistar neonatos (5º - 7° dia pós-natal), foi capaz de induzir um comportamento tipo-esquizofrenia na fase adulto jovem e adulto dos animais evidenciada por diminuições significativas do percentual de inibição pré-pulso (PPI) do reflexo do sobressalto. Estes animais também apresentaram aumento significativo no número de erros no teste de Y maze indicativo de comprometimento de memória de trabalho. As alterações comportamentais registradas nas idades adulto jovem e adulto não foram evidenciadas na adolescência dos animais. A avaliação por imunohistoquimica da enzima óxido nítrico sintase induzida (NOSi) nos tecidos cerebrais (CPF, CE e hipocampo), mostrou uma intensa marcação difusa nos tecidos do CPF e do CE e uma marcação de forte a moderada nas aréas do hipocampo de animais adultos submetidos ao desafio imune em comparação ao grupo adulto controle. Porém, uma leve marcação foi observada nos animais adolescentes, quando comparado aos demais grupos. Também foram observadas diferenças na intensidade de marcação entre os grupos adulto e adolescente tratados com Poly I:C, onde o grupo adulto apresentou maior intensidade de marcação. O tratamento com clozapina, por sua vez, foi capaz de reverter as alterações comportamentais e diminuir significativamente a marcação de NOSi em algumas áreas como o CPF e hipocampo, sendo menos evidente no corpo estriado. Os variados resultados de intensidade para as marcações imunohistoquímicas da NOSi podem ser justificados possivelmente pela diferença de receptores dopaminérgicos dos tecidos cerébrais estudados, onde se acredita que estes sistemas sofram influência moduladora direta do óxido nítrico. A avaliação por imunofluorescência para Iba-1 (marcador de micróglia) nas áreas cerebrais estudadas, principalmente no hipocampo demonstrou que as ramicações e os processos derivados das células microgliais dos ratos adultos expostos a Poly I:C apresentaram uma forte diminuição. Já o corpo celular microglial destes animais encontrava-se aumentado quando comparados aos animais adultos pertencentes ao grupo controle indicando, assim, uma elevada ativação microglial nos animais adultos desafiados com Poly I:C. Nos animais adolescentes tratados com Poly I:C esta ativação apresentou-se de forma leve a moderada. Em conclusão, os resultados do presente trabalho mostram de forma inédita a ativação de células microgliais em animais adultos submetidos ao desafio imune neonatal com poly I:C acompanhado por aumento na marcação de NOSi. A habilidade da clozapina em reverter as alteraçõs causadas pelo desafio imune em animais adultos indica a NOSi como novo possível alvo para a ação terapêutica da clozapina