Evolution of Hoxd gene regulation

The phenotypic diversity found in vertebrates is closely related to modifications in the transcription patterns of developmental genes. Developmental genes often participate in several patterning processes and are thus very well conserved. In contrast, their associated cis-regulatory elements (CREs) function in a mostly time and tissue specific manner. Genetic modifications within CREs may thus alter the pattern of expression of their target developmental gene in a spatiotemporal limited manner. Consequently, they may lead to morphological changes with less probability of associated lethality than mutations affecting coding sequences. For this reason, understanding the mechanisms of CREs evolution is key to gain insight into vertebrate diversification. In vertebrate genomes, the multiple CREs controlling the activity of common developmental target gene(s) are generally found in large genomic regions called ‘regulatory landscapes'. In addition, the limits of these regulatory landscapes often correspond to the boundaries of Topologically Associating Domains (TADs), suggesting a functional link between regulatory activities and chromatin organization. The mouse HoxD locus represents an excellent system to study evolution of gene regulation because it is conserved and used in multiple tissue types through development. In addition, the different regulatory mechanisms controlling Hoxd gene expression are physically divided by function into several regulatory landscapes, C-DOM and T-DOM; where the T-DOM is further subdivided. Remarkably, the different regulatory domains appear to match the sub-compartmentalization of the 3D genome. This correspondence provided an entrance to systematically test the relationship between genomic organization and gene regulation in an evolutionary perspective. In this work, we started by comparing some aspects of the Hox genomic organization in different chordate species and at different mouse Hox loci. This analysis created a framework for the interpretation and contextualization of the ensuing experiments. Then, we turned to an analysis of the transcription of anterior Hoxd genes in the mouse primordia of vibrissae follicles and somites, which we compared to the corresponding chicken tissues, the primordia of feather follicles and somites respectively. These structures arose independently over an enormous amount of time – approximately 300 million years separates the appearance of somites (chordates) and the evolution of the first skin appendages (tetrapods). Yet, we found that the transcription of Hoxd genes is controlled by regulatory elements located in the T-DOM that are sometimes common between the two tissue types. In addition, we show that CREs regulating Hoxd1 are systematically found in the same genomic region, which establish frequent interactions with its promoter, no matter the species (mouse, chicken) or the tissue analysed (skin primordia, somites). These findings are detailed in a first manuscript for publication, which is attached to this thesis. Our analysis about Hoxd1 regulation in mouse embryos led to a collaboration with the group of Aurélien Capitan (INRAE), which is attached to this thesis as an annex (Allais-Bonnet et al. 2021, Annex 1). This work showed that the presence of supernumerary horns in goats and sheep (polyceraty) was linked to alterations of HOXD1 function. The mapping of POLYCERATE alleles in four-horned goats revealed that the mutation responsible for this morphological alteration is a large deletion located in the T-DOM, complementing our findings about the evolution of Hoxd1 regulation. Altogether, our results highlight the deep conservation of the HoxD cluster topology throughout vertebrates, despite divergent nucleotide sequences and regulatory activities. They support and reinforce the proposal that 3D chromatin organization both facilitates the emergence of new enhancers and limit their range of action.La diversité phénotypique des vertébrés est fortement liée à des variations dans les patterns de transcription des gènes du développement. Ces gènes sont généralement impliqués dans plusieurs processus d'organogenèse et ont par conséquent été fortement conservés au cours de l'évolution. En revanche, leurs séquences régulatrices, appelées cis-regulatory elements (CREs), ont une activité majoritairement spécifique aux tissus et aux stades de développement. Ainsi, certaines modifications de ces séquences de régulation affectent le pattern d'expression de leur gène cible de manière limitée dans le temps et dans l'espace. De ce fait, elles sont plus susceptibles de provoquer des altérations morphologiques non létales que des modifications des séquences codantes. Une compréhension accrue des mécanismes entraînant l'évolution des séquences régulatrices permettrait donc d'améliorer nos déductions quant aux raisons de l'incroyable diversité biologique des vertébrés. Les génomes de ces animaux présentent des domaines de chromatine particuliers, appelés ‘paysages de régulation'. Ces paysages rassemblent une multitude de séquences régulatrices qui contrôlent à distance l'activité d'un ou plusieurs gènes de manière coordonnée. L'étendue des paysages de régulation coïncide souvent avec celle de structures topologiques d'interactions préférentielles (TADs pour ‘topological associating domains') au sein desquelles les séquences ont une probabilité accrue de se retrouver proches les unes des autres. Cette correspondance a conduit à l'idée que l'organisation fonctionnelle de la régulation génique à distance et l'organisation physique de la chromatine dans l'espace du noyau forment deux aspects interdépendants du génome. Le locus HoxD de la souris constitue un système adéquat pour étudier l'évolution de la régulation génique parce qu'il est fortement conservé et parce qu'il est actif dans de nombreux processus développementaux. Par ailleurs, les différents mécanismes de régulation qui contrôlent l'expression des gènes Hoxd sont compartimentés en différents paysages de régulation, le C-DOM (pour domaine centromérique) et deux domaines imbriqués plus petits formant le T-DOM (pour domaine télomérique). Chacun de ces paysages présente une structure topologique en TAD, formant un ensemble génomique qui permet de tester de manière systématique la corrélation entre l'organisation de la chromatine et la régulation génique dans une perspective évolutive. Pour ce travail, nous avons d'abord comparé certains aspects de l'organisation génomique entre des complexes Hox de différentes espèces de chordés, ainsi qu'entre les différents clusters Hox chez la souris. Cette analyse nous a permis de formuler un cadre théorique pour l'interprétation et la contextualisation des expériences suivantes. Nous avons ensuite analysé la transcription des gènes Hoxd antérieurs dans les primordia de vibrisses et les somites chez la souris que nous avons comparés aux tissus correspondant chez le poulet, à savoir les primordia de plumes et les somites. Les somites (chordés) et les premiers appendices cutanés (tétrapodes) sont apparus indépendamment sur terre il y a plus de 300 millions d'années. Nous avons pourtant montré que la transcription des gènes Hoxd dans ces structures est contrôlée par des éléments de régulation situés dans le T-DOM, et qui sont parfois communs entre les deux tissus. Nous montrons également que la régulation à distance de Hoxd1 dépend systématiquement d'une région génomique commune qui établit de fréquentes interactions avec son promoteur, indépendamment du type de tissus ou de l'espèce considérée. Les résultats de cette recherche sont détaillés dans un premier manuscrit pour publication, attaché à cette thèse. L'analyse de la régulation de Hoxd1 dans l'embryon de souris a conduit à une collaboration avec le groupe de recherche d'Aurélien Capitan (INRAE), qui est annexée à cette thèse (Allais-Bonnet et al. 2021, Annex 1). Ce travail montre que la présence de cornes surnuméraires chez les chèvres et les moutons, des animaux qualifiés de polycérates, est associée à des défaillances dans la fonction du gène HOXD1. La cartographie des allèles POLYCERATE chez la chèvre a permis de localiser la mutation responsable de cette anomalie anatomique au sein du T-DOM, ce qui complémente nos résultats quant à l'évolution de la régulation de Hoxd1. Nos résultats de recherche, considérés dans leur ensemble, mettent en évidence la forte conservation du complexe HoxD chez les vertébrés, et ce malgré de fortes divergences dans les séquences ADN ainsi que dans les activités régulatrices. Nos résultats soutiennent et renforcent l'hypothèse que l'organisation de la chromatine au sein du noyau facilite l'émergence de nouvelles régulations, tout en limitant leur portée