Mucus gel modifications through the delivery of molecules made up of CYS domains

Le mucus est un gel conservé chez les vertébrés et les invertébrés. Ses fonctions majeures sont la protection et l’hydratation des épithéliums non kératinisés. Les mucines gélifiantes sont des protéines multi-domaines qui s’associent en polymères linéaires et enchevêtrés pour former la matrice glycoprotéique du mucus. Les interactions covalentes bien caractérisées des mucines, mais aussi les associations non covalentes (réversibles),sont responsables du caractère viscoélastique du mucus. Le domaine CYS des mucines est retrouvé dans le mucus à la surface de toutes les muqueuses sécrétoires humaines. Il est très conservé chez les vertébrés et très hydrophobe. De ce fait, il est l’un des meilleur scandidats pour l’établissement de liaisons hydrophobes réversibles.L’objectif de ce travail est d’étudier l’impact d’un enrichissement en domaine CYS sur les propriétés des gels de mucus. Pour cela, un modèle murin transgénique (Tg222) e tune lignée cellulaire muco-sécrétante (HT29-MTX E12), sécrétant constitutivement une molécule recombinante composée de 12 domaines CYS consécutifs (rCYSx12), ont été développés. L’effet de la délivrance endogène de rCYSx12 sur la perméabilité du gel de mucus, la motilité cellulaire et les propriétés rhéologiques du gel ont été étudiés. Des modèles cellulaires sécrétant des molécules constituées de domaines CYS (poly-CYS) ont aussi été développés afin d’envisager la délivrance exogène de cette molécule, et d’étudier son effet dans un contexte pathologique.La délivrance endogène de rCYSx12 dans le mucus de la lignée cellulaireHT29-MTX E12 diminue la perméabilité du gel de mucus. La sécrétion de rCYSx12est également associée à une diminution de la motilité bactérienne (vitesse et linéarité du déplacement) dans les mucus des modèles cellulaire et murin. Les propriétés rhéologiques du mucus colique murin ont été déterminées à plusieurs échelles. La délivrance derCYSx12 entraîne un remodelage de la matrice protéique du mucus en réduisant la taille des mailles que forment les mucines gélifiantes. La production d’une molécule poly-CYS aété développée chez la levure Pichia pastoris et dans la lignée cellulaire d’origine humaineHEK293. Contrairement à P. pastoris, la lignée HEK293 produit et sécrète la molécule poly-CYS sans modifications importantes apparentes.La molécule rCYSx12 revêt un grand intérêt thérapeutique pour renforcer les gels de mucus dans des contextes pathologiques, comme la rectocolite hémorragique ou les infections intra-utérines. Le développement de modèles sécrétant stablement une molécule poly-CYS permettra de réaliser des tests de délivrance exogène, et ainsi déterminer le potentiel thérapeutique de cette molécule.Mucus is a gel conserved among vertebrates and invertebrates. Its major functions arethe protection and hydration of non-keratinized epithelia. Gel-forming mucins are multidomainproteins, which self-associate together to form linear and entangled polymers toform the mucus glycoprotein matrix. The well-characterized covalent interactions, but alsonon-covalent (reversible) links, are responsible for the viscoelastic character of mucus. Themucin CYS domain is found in mucus on the surface of all secretory human mucosae. Itis very well conserved in vertebrates and very hydrophobic. Thus, it is one of the bestcandidates for establishing reversible hydrophobic bonds.The aim of this work is to study the impact of CYS domain enrichment on propertiesof mucus gels. For this, a transgenic mouse model (Tg222) and a mucus-secretingcell line (HT29-MTX E12), constitutively secreting a recombinant molecule made of 12consecutive CYS domains (rCYSx12), were developed. The effect of endogenous deliveryof rCYSx12 on mucus gel permeability, cellular motility and rheological properties wasstudied (micro- and macro-scale). Cellular models secreting a molecule made up of CYSdomains (poly-CYS) have also been developed in order to consider the exogenous deliveryof this molecule, and to study its effect in a pathological context.Endogenous delivery of rCYSx12 into the mucus of the HT29-MTX E12 cell linedecreased the permeability of the mucus gel. The secretion of rCYSx12 was also associatedwith a decrease in bacterial motility (velocity and linearity of displacement) in the mucusof the cellular and mouse models. The rheological properties of the colonic mucus weredetermined at multi-scale levels. The delivery of rCYSx12 leads to a remodeling of the mucus protein matrix by reducing its mesh size. The production of a poly-CYS moleculewas developed in the yeast Pichia pastoris and in the human cell line HEK293. UnlikeP. pastoris, the HEK293 cell line produced and secreted the poly-CYS molecule withoutapparent modifications.The rCYSx12 is of great therapeutic interest for strengthening mucus gels in pathologicalcontexts such as ulcerative colitis or intrauterine infections. The development ofmodels stably secreting the poly-CYS molecule will make it possible to carry out exogenousdelivery tests, and thus to evaluate the therapeutic potential of this molecule