Investigation des Interactions Toxine-Cellule et du Confinement des Récepteurs dans la Membrane Cellulaire

The cell membrane is the interface of communication and exchange between thecell and the outside world. As such, its structure and composition is of integralimportance to the cell’s continued survival. The proteins within the membraneprovide the necessary functionalities to the membrane for successfully acting outits role. The membrane receptors experience a highly heterogeneous environmentin the cell membrane that enhances their efficiency. We studied this environmentvia single particle tracking of cell membrane receptors tagged with luminescentlanthanide-doped nanoparticles. The nanoparticles provided a continuous,uninterrupted signal of the movements, yielding trajectories of several minutes.We then used a method based on statistical Bayesian inference to analyse andcompare the trajectories obtained and, hence, extract a confinement potential ofarbitrary shape.We first validated the Bayesian inference approach by demonstrating that thismethod can also be used to calibrate an optical tweezers setup. Furthermore, weshowed that this method outperforms established calibration methods for opticaltraps. We then applied this approach to the confined trajectories of epsilon-toxin(produced by Clostridium perfringens) receptors in Madin-Darby canine kidneycells. In particular, we studied the evolution of the confinement potential anddiffusivity within the domains upon addition of domain-destabilizing agents, aswell as the occasional ‘hopping’ events, during which receptors are seen to hopinto an adjacent confinement domain, and the associated 'hopping' energies.Additionally, we inquired into the effect of an externally applied force,implemented via a hydrodynamic flow on the receptors, and discovered an actindependentconfinement of the microdomains in addition to the lipid-dependentconfinement.To further investigate the nature of membrane receptor confinement, weclassified the potentials obtained from raft and non-raft proteins using a decisiontreemethod and a clustering algorithm. The results showed that non-raft proteinsreside in domains that produce a steeper potential boundary with a flatterpotential in the centre of the domain as compared to raft proteins.Finally, we extended the single-particle tracking of toxins to three dimensions byregistering the width of the point-spread function of the nanoparticle signal. Inthis way, we were able to observe the internalization trajectory of a heavy-chainsegment of the botulinum toxin A of Clostridium botulinum in cells of the intestinalmouse cell line m-ICcl2.La membrane cellulaire est l’interface de communication et d’échange entre lacellule et le monde extérieur. En tant que telle, sa structure et composition ont uneimportance centrale à la viabilité de la cellule. Les protéines qui résident dans lamembrane apportent la fonctionnalité nécessaire pour permettre à la membraned’accomplir ces tâches. Ces récepteurs se retrouvent dans un environnement dehaute hétérogénéité qui renforce leur efficacité. Nous avons étudié cetenvironnent en suivant des récepteurs uniques dans la membrane grâce auxnanoparticules dopées aux terres rares. Ces nanoparticules produisent dessignaux continus, non-interrompus, permettant de suivre des trajectoires pendantplusieurs minutes. Nous avons ensuite utilisé une méthode basée sur l’inférencebayésienne pour analyser et comparer les trajectoires obtenues, et pour extrairele potentiel de confinement de forme arbitraire correspondant à chaquetrajectoire.Nous avons d’abord validé l’approche de l’inférence bayésienne en démontrantque cette méthode peut également être utilisée pour la calibration d’un montagede pinces optiques. Par ailleurs, nous avons démontré que cette approche estsupérieure aux techniques couramment utilisées pour la calibration des pincesoptiques. Puis, nous avons appliqué cette méthode aux trajectoires des récepteursde la toxine epsilon (de Clostridium perfringens) dans des cellules rénales canines Madin-Darby (MDCK). En particulier, nous avons étudié l’évolution du potentiel deconfinement et de la diffusivité à l’intérieur des domaines confinant les récepteurspendant l’action d’un agent déstabilisant les domaines de confinement, ainsi queles événement de ‘hopping’ pendant lesquels le récepteur change de domaine deconfinement, et déterminé les énergies de ‘hopping’ associées. De plus, nousavons observé l’effet d’une force externe appliquée au récepteur, produite par unflux hydrodynamique. L’application d’une force a mis en évidence une dépendancedu confinement des récepteurs du cytosquelette d’actine en plus du confinementproduit par la distribution des lipides.Pour approfondir notre investigation du confinement des récepteurs de lamembrane, nous avons classifié les potentiels de confinement obtenus pour lesrécepteurs résidant à l’intérieur et à l’extérieur des radeaux lipidiques. Lespotentiels ressentis par les récepteurs en dehors des domaines lipidiques sontplus plats au centre du domaine de confinement et plus abrupts vers les bords dudomaine par rapport aux potentiels ressentis par les protéines dans les radeaux.Enfin, nous avons étendu la technique de suivi de particules uniques en 3D enutilisant la largeur de la fonction de réponse du signal de la nanoparticule. De cettemanière, nous avons observé le mouvement d’internalisation de nanoparticulescouplées à un fragment de la chaine lourde de la toxine botulique A de Clostridiumbotulinum dans des cellules intestinales de souris de la lignée m-ICcl2