Development and biological characterization of novel ligands for protein-protein interaction-based effects of prolyl oligopeptidase

Most neurodegenerative diseases (NDD) are characterized by accumulation of toxic protein species leading to the loss of movement and cognitive disorders. In the two most common NDD Parkinson´s disease (PD) and Alzheimer´s disease (AD), there are almost 60 million patients worldwide. In the U.S, there were one million PD patients and an estimated economic burden of 51.9 billion dollars in 2017. As there is no disease-modifying therapy available, NDD lead to loss of life quality and eventually to untimely death. Current drug therapies for PD can only relieve symptoms of the disease by increasing dopaminergic activity in the brain but they do not address the underlying mechanisms of the disease such as clearance of detrimental protein aggregates. In previous studies, prolyl oligopeptidase (PREP) has been shown to negatively regulate autophagy and enhance the aggregation of alpha-synuclein (αSyn). Thus, PREP inhibitors have been shown to reduce aggregation and increase clearance of αSyn aggregates via enhanced autophagy. These mechanisms are mediated by protein-protein -interactions (PPI) of PREP with other proteins. Several small molecular inhibitors of PREP have been developed to target memory disorders, cancer, and NDD. However, none of these PREP inhibitors are in therapeutical use. The aim of this study was to investigate the effect of these inhibitors in two neurodegeneration-related functions of PREP: autophagy and αSyn dimerization. A further aim was to synthesize novel PREP ligands targeted to modulate these PPI-mediated functions of PREP. In the first part of this study, a structurally diverse set of 12 potent PREP inhibitors were tested in in vitro assays of autophagy and αSyn dimerization. The study revealed that the least potent inhibitor with IC50-value of 1010 nM had the most prominent effect on reduction of αSyn dimers and enhancing autophagy, while some of the highly potent inhibitors with IC50-value ranging from 0.32 to 1.2 nM did not have an effect on autophagy or αSyn dimerization. In the second part of the study, novel 4-phenylbutanoyl-α-aminoacyl-2(S)-tetrazolyl-pyrrolidines were designed and synthesized to target αSyn dimerization. Synthesized compounds had IC50-values ranging from 12 nM to 200 000 nM, but they all reduced αSyn dimerization in a cellular assay. Furthermore, molecular docking studies showed that these novel compounds have another putative binding mode to PREP compared to typical PREP inhibitors. These findings combined with the findings from the first part of the study suggest that the PREP mediated reducing effect on αSyn dimerization and enhancing effect on autophagy is not dependent on the magnitude of PREP inhibition but more likely due to conformational stabilization in PREP caused by ligand binding. Another speculative explanation is that PREP has another binding site, which modulates the conformation of PREP and thereby the PPI mediated functions of PREP. In the third part of the study, a human αSyn transgenic mouse, carrying A30P and A53T point mutations in αSyn was characterized and evaluated as a model for early onset PD. The model displayed behavioral alternations at an early age with differences in dopaminergic neurotransmission in the nigrostriatal pathway and accumulation of oligomeric αSyn leading to decreased tyrosine hydroxylase in the striatum and substantia nigra. Furthermore, we evaluated the effect of seven days treatment by the novel PREP inhibitor, HUP-55, in this model. Results in this study showed that HUP-55 was able to decrease the level of oligomeric αSyn in the striatum and substantia nigra. In summary, this study revealed and highlighted the disconnected structure-activity relationships between inhibition of the proteolytic activity and the PPI mediated functions of PREP. Moreover, this finding led to the development of a novel PREP ligand that was successfully tested in a PD mouse model. Useimmissa keskushermostoa rappeuttavissa sairauksissa havaitaan haitallisten proteiinien kertymistä aivoihin, mikä johtaa kognitiivisiin oireisiin sekä tahdonalaisten liikkeiden häiriöihin. Yleisimmät keskushermostoa rappeuttavat sairaudet ovat Alzheimerin tauti ja Parkinsonin tauti, joita sairastaa lähes 60 miljoona ihmistä maailmassa. Keskushermostoa rappeuttaviin sairauksiin ei ole parantavaa tai taudin etenemistä hidastavaa hoitoa, joten ne johtavat väistämättä elämänlaadun heikentymiseen ja lopulta ennenaikaiseen kuolemaan. Tällä hetkellä Parkinsonin taudin oireita pystytään lievittämään lisäämällä keskushermoston dopamiinin aktiivisuutta aivoissa, mutta tämä ei vaikuta taudin taustalla oleviin mekanismeihin kuten haitallisten proteiinikertymien poistumiseen aivoista. Aikaisemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että prolyyli oligopeptidaasi (PREP) vähentää autofagiaa sekä lisää haitallisten alfasynukleiini-proteiinikertymien muodostumista. Toisaalta, PREP:n estämisen on osoitettu vähentävän alfasynukleiinin kertymistä keskushermostoon ja lisäävän sen puhdistumista autofagian avulla. Nämä prosessit johtuvat PREP:n ja muiden proteiinien välisistä suorista proteiini-proteiini vuorovaikutuksista. Lukuisia pienimolekyylisiä PREP-estäjiä onkin kehitetty muistihäiriöiden, syövän ja keskushermostoa rappeuttavien sairauksien hoitoon, mutta mikään näistä ei ole päätynyt markkinoille. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia PREP-estäjien vaikutusta kahteen keskushermoston rappeutumiseen liittyvään mekanismiin: autofagian säätelyyn ja alfasynukleiinin kertymiseen. Tämän tutkimuksen ensimmäisessä osassa selvitettiin 12 tehokkaan PREP-estäjän vaikutuksia autofagiaan ja alfasynukleiinin kertymiseen in vitro. Suurin vaikutus autofagiaan sekä alfasynukleiinikertymien vähentymiseen saatiin heikoimmalla PREP-estäjällä, samalla osa tehokkaista PREP-estäjistä eivät saaneet aikaan haluttuja vaikutuksia. Toisessa osassa tätä tutkimusta suunniteltiin ja syntetisoitiin uudenlaisia PREP-ligandeja, joilla pyrittiin vähentämään alfasynukleiinin kertymistä. Osa näistä yhdisteistä olivat heikkoja PREP-estäjiä, mutta kaikki yhdisteet vähensivät kuitenkin alfasynukleiinin kertymistä solukokeessa. Lisäksi molekyylien telakointi tietokoneavusteisesti osoitti, että nämä yhdisteet sitoutuvat eri tavalla PREP:iin kuin tyypilliset PREP-estäjät. Yhdistettynä ensimmäisen osakokeen havaintoihin, voidaan todeta, että PREP-välitteinen alfasynukleiinin kertymisen vähentyminen ja autofagian kiihtyminen ei ole riippuvainen PREP eston voimakkuudesta vaan todennäköisesti ligandin sitoutumisen aiheuttamasta stabilisaatiosta tiettyyn PREP konformaatioon. On myös mahdollista, että PREP:ssa on toinen sitoutumispaikka ligandeille, mikä säätelee PREP:in konformaatiota ja näin ollen proteiini-proteiini-vuorovaikutuksisten säätelemiä mekanismeja. Kolmannessa osakokeessa karaketerisoitiin siirtogeenisen hiirilinjan, joka kantoi A30P ja A53T pistemutaatioita alfasynukleiinigeenissä, ominaisuuksia mallintaa aikaisen vaiheen Parkinsonin tautia. Hiirillä havaittiin muutoksia käytöksessä sekä dopaminergisessa signaalinvälityksessä sekä alfasynukleiinin kertymisessä, joka johti hermosolujen vähentymiseen aivojuoviossa ja mustatumakkeessa. Lisäksi tutkimme uuden PREP-ligandi HUP-55:en vaikutuksia näihin hiiriin seitsemän päivän hoidon jälkeen. Havaittiin, että HUP-55 vähensi kertyneen alfasynukleiinin määrää aivojuoviossa sekä mustatumakkeessa. Yhteenvetona, tämä tutkimus paljasti epäjohdonmukaisuuden rakenneaktiivisuussuhteessa PREP:n aktiivisuuden estämisen sekä proteiini-proteiini-vuorovaikutus välitteisten PREP-vaikutusten välillä. Lisäksi tässä tutkimuksessa löytyi kokonaan uudenlainen PREP-ligandi, joka testattiin onnistuneesti Parkinsonin taudin hiirimallissa