Multi-targeted strategies for modulating receptor and non- receptor tryosine kinases involved in adverse signaling in solid tumours

Targeted therapy is designed to block specific oncogenic products involved in disordered signaling, with the purpose of inducing selective therapy. However the activation of compensatory and alternate signaling pathways to bypass the inhibitory effects of targeted therapies has led to both intrinsic and acquired resistance. Here, in order to abrogate these adverse signaling nodes, we investigated two major approaches: (a) the design of single agents termed "combi-molecules" targeted to key players of multiple signaling pathways and (b) the determination of Achilles' heels in this complex network of signaling pathways to be targeted for effective therapy. This thesis focuses on the targeting of EGFR, c-Src and c-Met, three tyrosine kinases that are involved in adverse signaling in solid tumours. Our results showed that: (a) programming AL622, a single molecule targeted to EGFR and c-Src, to further release two intact kinase inhibitors, AL621 (EGFR inhibitory arm) and PP2 (c-Src inhibitory arm) did not suffice to induce sustained and balanced EGFR-c-Src targeting, (b) substituting the PP2 moiety for a thiazolylaminopyrimidine scaffold, led to AL776, a balanced EGFR-c-Src targeting combi-molecule, which permitted the validation of a new targeting model termed "type III combi-targeting". Further investigation on the mode of targeting of multiple signaling pathways led to the molecular analysis of concomitant administration of 2-4 clinical kinase inhibitors to induce tandem blockade of EGFR, c-Met, c-Src and STAT3. We discovered that despite the complex signaling evoked by these three tyrosine kinases, targeting only two kinases, which we refer to as the Achilles' heels of the signaling network was sufficient to induce potent growth inhibition. Furthermore, we developed parameters to evaluate the efficacy of single multi-targeted molecules (e.g. combi-molecules) in comparison with equimolar 2-drug combinations. This has led to the definition of the principle of "balanced targeting" according to which an equimolar combination is said to be "balanced" when the IC50 values of growth inhibition for the two drugs in combination is less than that of each individual drug. Using data generated from a large number of experiments, we found that balanced targeting could be observed when the fold-difference between the IC50 values of two individual drugs was less than or equal to 6 and established a new parameter ε termed "potency index" that can be used to assess balanced targeting. We discovered a significantly linear correlation (R2=0.95) between ε and the fold-differences between the IC50 values of the two individual drugs. Combi-molecules being theoretically designed to generate effects corresponding to equimolar combinations, we established that they should be compared with the latter only when they are balanced. Thus, a new parameter Ω defined as the IC50 value for growth inhibition over that of a "balanced targeted" equimolar combination was proposed for measuring the potency of combi-molecules. Based upon our data, a given equimolar combination can be used as a reference for determining the potency of a combi-molecule, only when its ε value is less than 5 and the latter agent can be considered for further development only when Ω is less than or equal to 1. Our results in toto suggest that multi-targeted approaches to block adverse effects of key oncogenic kinases is a promising strategy for the abrogation of complex signaling pathways in refractory tumours.Les thérapies ciblées ont été conçues dans le but de bloquer des cibles oncogéniques spécifiques dans des voies de signalisation dérégulées, afin d'induire une thérapie sélective. Cependant, l'activation de voies de signalisation compensatoires et alternatives permettant d'outrepasser les effets inhibiteurs des thérapies ciblées a entraîné l'apparition de résistances intrinsèques et acquises. Ici, dans le but de supprimer ces nœuds de signalisation défavorables, nous avons étudié deux approches majeures : (a) la conception de molécules uniques appelées « combi-molécules » ciblant des acteurs clés de nombreuses voies de signalisation cellulaire et (b) la mise en évidence du talon d'Achille de ces réseaux complexes de signalisation dont le ciblage permettrait d'accroitre l'efficacité thérapeutique. Cette thèse se focalise sur le ciblage d'EGFR, c-Src and c-Met, trois tyrosines kinases induisant des effets pro-tumoraux dans les tumeurs solides. Nos résultats montrent que : (a) programmer AL622, une molécule ciblant EGFR et c-Src, à libérer deux inhibiteurs de kinases intactes, AL621 (bras inhibiteur d'EGFR) et PP2 (bras inhibiteur de c-Src) ne permet pas un ciblage stable et, équilibré de la signalisation EGFR-c-Src (b) substituer la fraction PP2 par une moitié thiazolylaminopyrimidine a mené au développement de l'AL776, une combi-molécule ciblant de façon équilibrée EGFR-c-Src, permettant ainsi la validation d'un nouveau mode de ciblage nommé combi-ciblage de type III. Des études plus approfondies sur le mode de ciblage de plusieurs voies de signalisation cellulaire ont entraîné l'analyse moléculaire d'une administration concomitante de 2-4 inhibiteurs de kinases cliniques afin d'induire le blocage en tandem d'EGFR, c-Met, c-Src et STAT3. Nous avons découvert que malgré les signalisations complexes évoquées par ces trois tyrosines kinases EGFR, c-Met et c-Src, cibler seulement deux kinases, que nous désignons comme le talon d'Achille du réseau, était suffisant pour induire une forte inhibition de la croissance cellulaire. Par ailleurs, nous avons développé des paramètres permettant d'évaluer l'efficacité de molécules uniques multi-cibles (telles que les combi-molécules) en comparaison avec une combinaison équimolaire de deux molécules. Ceci a permis la définition du principe de « ciblage équilibré » selon lequel une combinaison équimolaire est dite « équilibrée » quand sa valeur d'IC50 est inférieure à celle de chacune des molécules seules. Par l'utilisation de données générées à partir de nombreuses expériences, nous avons mis en évidence qu'un ciblage équilibré pourrait être observé quand la différence entre les IC50 des deux molécules seules était inférieure ou égale à 6, et nous avons établi un nouveau paramètre ε nommé « indice de potentialité » pouvant être utilisé pour évaluer un ciblage équilibré. Nous avons trouvé une corrélation linéaire significative (R2=0,95) entre ε et la différence entre les IC50 des deux molécules. Les combi-molécules étant théoriquement conçues pour générer des effets similaires à une combinaison équimolaire, nous avons établi qu'elles devaient être comparées à cette dernière seulement quand elles sont équilibrées. Ainsi, un nouveau paramètre Ω, établi comme l'IC50 de l'inhibition de croissance divisée par celle d'une combinaison équimolaire équilibrée, a été défini afin de mesurer l'efficacité des combi-molécules. Selon nos données, une combinaison équimolaire donnée peut servir de référence afin de déterminer l'efficacité d'une combi-molécule, seulement quand sa valeur ε est inférieure à 5 et cette molécule ne peut être considérée digne d'un développement approfondi que quand Ω est inférieur à 1. Nos résultats in toto suggèrent que les approches multi-ciblées visant à bloquer les effets négatifs et compensatoires de kinases oncogéniques clés est une stratégie prometteuse permettant d'abroger les signalisations complexes dans les tumeurs réfractaires