Exploration des récepteurs à dépendance dans les hémopathies malignes

Cellular receptors are normally divided into two large families according to their ability to induce signaling pathways. The first family includes the classic receptors which work as an on/off switch that induces a positive signaling pathway in the presence of their ligand and which are deactivated in the absence of the ligand. The second family, in which we are interested in this thesis, is a recently described cell membrane receptors called dependence receptors which are always active; in the presence of their ligand, these receptors induce a “positive” signaling pathway often leading to cell survival and in the absence of their ligand, they induce a “negative” signaling pathway often leading to apoptosis by extrinsic activation of caspases. The main objective of the work of this thesis is to explore the role of dependence receptors and to assess the effect of their targeting in hematological malignancies by a new immunotherapy. First, we screened different types of hematological malignancies for the expression of netrin-1 and its dependence receptors, DCC and UNC5B, in order to determine the potential cell lines for netrin-1 targeting by a proposed humanized anti-netrin-1 antibody. According to these screenings, mantle cell lymphoma non-Hodgkin's lymphomas (NHL) and multiple myelomas (MM) appear to be the main target malignancies for anti-netrin-1 treatment (NP137). NP137 appears to be effective against NHL by targeting netrin-1 both secreted in a paracrine and / or autocrine fashion in an established co-culture model. In addition, in an NHL model, netrin-1 seems to accelerate cell proliferation evaluated by the CFSE test. As for multiple myelomas, screening data for netrin-1 and its receptors obtained from patient samples seem to show an overexpression of these proteins in patients suffering from this disease. Targeting netrin-1 in this type of hematological malignancies appears to reduce the cell viability of a multiple myeloma cell model by combining it with a proteasome inhibitor, bortezomib. In vivo treatment with NP137 of mice grafted with ectopic xenografts of multiple human myelomas significantly reduced tumor growth compared to untreated mice only when it was combined with dexamethasone. Ex vivo treatment with NP137 of MM samples from patients appears to reduce the percentage of plasma cells in some fresh samples of bone marrow. In the second part of the thesis, we will focus on the evaluation of the targeting and prognostic value of ectodysplasin A1 (EdaA1) and its dependence receptor EDAR in acute myeloid leukemia (AML) following unpublished TCGA data which suggest an overexpression of this couple in this type of hematological malignancies. Our screening results show both overexpression of this couple in 3 AML cell models and suggest overexpression of EdaA1 and EDAR in a cohort of 220 AML patients. In vitro, treatment with proposed anti-EdaA1 antibody (NP604) of cell models does not affect their viability except when combined with a potential cFLIP inhibitor, lupeol, suggesting a role for this protein in the resistance of this type of malignancies to the proposed treatment. Analysis of the expression and the cleavage of cFLIP and caspase-8 in the AML lines treated with lupeol showing a cleavage of these two proteins after treatment suggests that lupeol impacts the interaction of the death domain of EDAR with cFLIP and caspase-8 in a similar way to what happens in the case of death receptors. These results require confirmation by studying the interactions of these proteins with each other.If these data are confirmed, targeting the signaling pathways of dependence receptors could be considered in these two types of cancerLes récepteurs cellulaires membranaires se divisent normalement en deux grandes familles selon leur capacité d’induction des voies de signalisation. La première famille sont les récepteurs classiques qui induisent une signalisation positive qui active une voie de signalisation sous-jacente en présence de leur ligand et qui sont inactifs en absence du ligand. La deuxième famille de récepteurs sont les récepteurs à dépendance qui se comportent différemment : en présence de leur ligand, ces récepteurs induisent une voie de signalisation « positive » induisant souvent la survie et la prolifération cellulaire et en absence de leur ligand, ils induisent une voie de signalisation « négative » menant à l’activation de l’apoptose par activation extrinsèque des caspases. L’objectif principal des travaux de cette thèse est d’explorer le rôle des récepteurs à dépendance et d’évaluer l’effet de leur ciblage dans les hémopathies malignes par une nouvelle immunothérapie. Dans un premier lieu, nous avons criblé différents types d’hémopathies malignes pour l’expression de la nétrine-1 et de ses récepteurs à dépendance, DCC et UNC5B, afin de déterminer les lignées cellulaires potentielles pour le ciblage de la nétrine-1 par un anticorps anti-nétrine-1 humanisé. Selon les résultats de ce criblage, les lymphomes non-hodgkiniens (LNH) à cellules du manteau et les myélomes multiples (MM) paraissent être les principales hémopathies cibles pour des traitements ciblant la nétrine-1. L’anticorps anti-nétrine-1 NP137 semble être efficace contre les LNH en ciblant la nétrine-1 à la fois secrétée d’une façon paracrine et/ou autocrine dans un modèle de co-culture. Quant aux myélomes multiples, des données de criblage de la nétrine-1 et de ses récepteurs obtenus sur des échantillons de patients semblent montrer une surexpression de ces protéines chez les patients atteints de cette maladie. Le ciblage de la nétrine-1 dans ce type d’hémopathies semble réduire la viabilité cellulaire d’un modèle cellulaire de myélome multiple en le combinant avec un inhibiteur de protéasome, le bortézomib. In vivo le traitement par NP137 des souris porteuses de xénogreffes de lignées de myélomes multiples humains ne réduit la croissance tumorale significativement par rapport aux souris non-traitées que lorsqu’il est combiné à la dexaméthasone. Par ailleurs le traitement ex vivo par NP137 des échantillons frais de MM provenant des patients, semble réduire le pourcentage des plasmocytes dans les échantillons frais de moelle osseuse chez certains patients. Dans la deuxième partie de la thèse nous nous sommes intéressés à l’évaluation de l’ectodysplasine A1 (EdaA1) et son récepteur à dépendance EDAR dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), suite à des données non publiées du TCGA qui suggèrent une surexpression de ce couple dans ce type d’hémopathies. Nos résultats de criblage montrent à la fois une surexpression de ces molécules dans 3 modèles cellulaires de LAM et suggèrent une surexpression de EdaA1 et d’EDAR dans une cohorte de 220 patients de LAM. In vitro, le traitement par un anticorps anti-EdaA1 (NP604) des modèles cellulaires n’impacte pas leur viabilité sauf quand on le combine avec un inhibiteur potentiel de cFLIP, le lupéol, suggérant un rôle de cette protéine dans la résistance de ce type d’hémopathies au traitement. L’analyse de l’expression et du clivage de cFLIP et de la caspase-8 dans les lignées de LAM traitées par le lupéol montrant un clivage de ces deux protéines après traitement suggère que le lupéol impacte l’interaction du domaine de mort d’EDAR avec cFLIP et caspase-8 d’une manière similaire à ce qui se passe dans le cas des récepteurs de mort. Ces résultats exigent une confirmation à travers l’étude des interactions de ces protéines entre elles. Si ces données sont confirmées, le ciblage de la signalisation des récepteurs à dépendance pourrait être envisagé dans ces deux types de cance