Skin innervation patterns and neurotrophic factor expression in neuropathic pain models

Neuropathic pain presents itself with many faces. It can be devastatingly painful leading to a person's inability to lead a productive life or it can be mild. In this thesis I discuss one of the countless possible mechanisms which could underlie the development and maintenance of this disorder; namely the involvement of peripheral changes in innervation. The approach taken in this thesis was mainly based on protein analyses, based on the assumption that protein expression (or lack thereof) is indicative of changes in the physiological properties of structures that either express or secrete proteins. I also address the models which are commonly used by researchers to elucidate the mechanisms underlying chronic neuropathic pain in hopes of developing viable treatments. The focus of this work is on the periphery, more specifically involving the glabrous skin of the rat hind paw. This skin is innervated by branches of the sciatic nerve which are comprised of, in part, sensory fibres. These are sub-classified into the thickly and thinly myelinated A-beta and A-delta afferents, respectively, as well as unmyelinated C-fibres. The latter population can be divided into two subgroups based on their peptide content where the peptide rich are termed peptidergic and the peptide-poor, non-peptidergic. This area also receives innervation from post-ganglionic sympathetic efferents. This thesis comprises three experimental chapters of my independent work into further exploring the models and mechanisms underlying the maintenance and generation of neuropathic pain. The first experimental chapter addresses the long term changes of skin innervation which occur following the application of a commonly used model of neuropathic pain, namely the chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve model. I examined the myelinated afferent population as a whole, the unmyelinated peptidergic afferents as well as the non-peptidergic C-fibres from three days through 1.5 years following the application of the nerve injury. There was a persistent loss of myelinated afferents, loss and delayed sprouting of non-peptidergic C-fibres as well as a brief loss and permanent sprouting of peptidergic afferents within the upper dermis. The second study is a comparative examination of the morphological and behavioural changes following application of two very similar models of neuropathic pain. The CCI model is based on the application of loose chromic gut ligatures and the variation of this is the cuff model in which the chromic gut ligatures are replaced by a fixed diameter polyethylene cuff. The application of the cuff model resulted in a persistent mechanical hypersensitivity in contrast to the CCI in which the mechanical hypersensitivity resolved within about a month. However, the application of either model resulted in a transient thermal hypersensitivity. Innervation changes following application of the cuff model included a reduction in myelinated afferent density within the upper dermis in both models, the unmyelinated, non-peptidergic afferents declined in fibre density followed by a delayed recovery in the cuff model and the peptidergic afferents gradually declined and remained so following application of the cuff in contrast to the application of the CCI. The third chapter addresses the changes in the expression of nerve growth factor (NGF) and its receptors following CCI. The precursor form of NGF, proNGF was localized to mast cells, vascular endothelium and keratinocytes in the epidermis in naïve skin. Following injury, proNGF increased. After lesion, Schwann cells expressed high levels of the NGF receptor p75. The two receptors for NGF, TrkA and p75, were differentially regulated during the progression of the nerve injury. The work of this thesis has provided new findings documenting the morphological changes underlying the generation and maintenance of neuropathic pain as well as the molecular generators of these changes.La douleur neuropathique peut se présenter sous plusieurs formes. Dans cette thèse, j'analyse les mécanismes périphériques pouvant déclencher et maintenir la douleur neuropathique. L'approche adoptée dans cette thèse est surtout basée sur une analyse de la concentration et distribution anatomique de protéines, avec l'idée sous-jacente que son niveau d'expression (ou absence d'expression) est révélatrice de changements physiologiques dans les structures qui produisent ou sécrètent ces protéines. Le focus de ce travail se déroule dans la périphérie, en particulier la peau non couverte de poils de la surface plantaire du membre postérieur du rat. Cette peau est innervée par des fibres nerveuses sensorielles provenant du nerf sciatique. Ces fibres sont normalement classées comme afférences myélinisées épaisses et finement myélinisées (A-bêta et A-delta respectivement), ainsi que comme fibres amyéliniques (C). La dernière population peut être divisée en deux sous-groupes en fonction de présence ou absence de neuropeptides en peptidergiques et non-peptidergiques. Cette région reçoit également une innervation par des fibres post-ganglionnaires sympathiques. Cette thèse est composée de trois chapitres expérimentaux. Le premier chapitre se penche sur les changements à long terme de l'innervation cutanée qui se produisent après l'application d'un modèle de douleur neuropathique couramment utilisé, à savoir la blessure par constriction chronique du nerf sciatique (CCI). J'ai examiné les changements des fibres myélinisées, des fibres amyéliniques peptidergiques, ainsi que des fibres non-peptidergiques dès trois jours après l'application de la lésion jusqu'à un an et demi après la lésion. Il y avait une perte persistante des afférences myélinisées, une perte suivie d'une récupération tardive des fibres C non-peptidergiques ainsi qu'une brève perte suivie de récupération permanente des afférences peptidergiques dans la partie supérieure du derme. Le second chapitre expérimental est un examen comparatif des changements morphologiques après l'application de deux modèles très similaires de douleur neuropathique. Le premier est la constriction chronique du nerf sciatique (CCI) suivant l'application de 4 ligatures; dans le deuxième la constriction du nerf sciatique est obtenue par l'application autour du nerf d'un segment de tube polyéthylène (cuff). L'application du « cuff » résultait en une hypersensibilité mécanique persistante, contrairement au CCI dans lequel l'hypersensibilité mécanique disparaissait dans un mois environ. Toutefois, les résultats de l'application des deux modèles sur la sensibilité thermique étaient similaires, avec une hyper-sensitivité à la chaleur qui durait environ un mois. Les afférences myélinisées étaient réduites en densité dans la partie supérieure du derme dans les deux modèles et cette baisse était permanente. Cependant, les afférences non-peptidergiques ont souffert une baisse de densité suivie d'un retour retardé à des valeurs des contrôles dans le modèle « cuff ». Dans ce dernier modèle, les afférences peptidergiques ont diminué progressivement en densité et n'ont pas récupéré, à la différence de l'application de la CCI. Le troisième chapitre expérimental concerne les changements dans l'expression du facteur de croissance nerveuse (NGF) et de ses récepteurs dans des animaux avec une lésion CCI. Le précurseur du NGF, proNGF a été localisé dans l'épiderme de la peau naïve. À la suite de la lésion CCI, nous avons détecté une augmentation du proNGF. Après la lésion, les cellules de Schwann avaient une expression très augmentée du récepteur du NGF p75. Les récepteurs au NGF, TrkA et p75 sont différentiellement régulés dans la période après la lésion du nerf. Le travail de cette thèse a eu comme objectif de clarifier les changements morphologiques contribuant au déclanchement et la manutention de la douleur neuropathique, ainsi que les mécanismes moléculaires de ces changements