Dissezione genetica della spermatogenesi in Drosophila melanogaster: caratterizzazione genetica, citologica e molecolare di un gruppo di mutanti maschio-sterili coinvolti nel ciclo cellulare meiotico

My research was focused on a set of ethyl methanesulfonate (EMS)-induced male sterile recessive mutations mapping to chromosomes 2 and 3 in Drosophila melanogaster. The fruitfly is anamenable system to study spermatogenesis process for several reasons: ease of cytological analysis; availability of mutations at any step; and highly improved methods of genetic and molecular investigation. My study consisted in the genetic, molecular and cytological dissection of two groups of Drosophila male sterile mutants: twine-noncomplementing and twine-complementing mutants. Twine is a gene mapping on the left arm of chromosome 2 and encoding for a phosphatase responsible for the triggering of the Cdc2-CyclinB complex, underlying meiotic entry. tweHB5 loss of function mutation causes the primary spermatocytes to fail both meiotic divisions, yet allowing some further spermatid differentiation. However, the ensuing phenotype is sterile, since the sperms are not mobile. The set of EMS-induced male sterile mutations I’ve been handling showed a mutant phenotype resembling that of tweHB5, thus, implying the possibility that the twinenoncomplementing mutations were allelic to twine. Mapping of such mutations by meiotic recombination together with sequencing of twine region in the genome of these flies suggested that 12-228, 60-40 and 54-23 mutations had two mutations on chromosome 2 selected for male sterility: one accounting for male sterility and the other one on twine gene, underlying the meiotic phenotype. The just mentioned results were also supported by the “cleaning” of the chromosome 2, carried out in these mutants by meiotic recombination. Different were the outcomes from 50-38 stock, another twine-noncomplementing mutation. In this case, recombination mapping and twine sequencing as well as chromosome “cleaning” suggested the presence of a single mutation on chromosome 2 of these mutants, close to twine gene, underlying both male sterility and meiotic phenotype. A detailed cytological analysis of this mutant by antibodies against some basic effectors of meiotic cell cycle, like α-tubulin to detect meiotic spindle, lamin for nuclear envelope and Spd2 for centrosomes, proved the failure of nuclear envelope breakdown and spindle assembly besides defects in number and localization of centrosomes in primary spermatocytes. Such anomalies underlie the failure of meiosis in 50-38 male mutants. Cytological characterization also revealed defects during the later stages of spermatogenesis, consisting into mislocalization of basal body that prevented a proper cyst polarization. Among the twine-complementing mutations, one, named 71-43, resulted extremely interesting because of the following features. Mapping data by recombination and deficiency, and chromosome “cleaning” placed it on the distal portion of the right arm of the chromosome 2 as the only mutation present on this chromosome, responsible for meiotic and sterile phenotype. Cytological dissection of the spermatogenesis process in these mutants by means of antibodies provided the evidence of a panoply of anomalies, starting from young primary spermatocytes until to spermatids. In particular, defects of nuclear envelope, centrosomes and meiotic spindle were detected by immunofluorescence experiments in the early stages of male germ line development as well as impairment of nucleus-basal body docking, cyst polarization and spermatid individualization processes in the later stages. The failure of assembly of a canonical meiotic cell cycle machinery accounted for the execution of only one, as well defective, meiotic division in 71-43 male mutants. 71-43 homozygous mutant females showed reduced fertility, thus indicating that the function performed by this gene in oogenesis is likely redundant. A lower mitotic index in mutant larval brains in comparison with wildtype, pointed out that 71-43 acts also in mitosis, even though its action should be dispensable since no delayed development nor lethality are apparent. Towards the molecular identification of the gene mutated in 71-43 stock, different approaches were followed, both via forward and reverse genetics. Complementation analysis of males heterozygous for 71-43 mutation and a mutated allele of most of the genes embedded into the region where 71-43 was identified to lie, allowed to rule out all the genes so far tested as candidates for 71-43 locus. Proteomics approach, consisted in a comparative study of protein profiles of 71-43 homozygote vs 71-43 heterozygote testes, underlined the presence of some proteins misregulated in 71-43 mutants, whose genes however map outside the 71-43 genetic interval. Such an analysis, however, provided intriguing clues about the putative pathways where 71-43 may act and, therefore, new roads to pursue.La mia ricerca nel corso del dottorato si è concentrata su un gruppo di mutazioni recessive maschiosterili, indotte da etil metansulfonato (EMS), localizzate sui cromosomi 2 e 3 in Drosophila melanogaster. Il moscerino della frutta è un sistema modello per lo studio del processo della spermatogenesi per varie ragioni: la facilità di indagine citologica, la disponibilità di mutazioni ad ogni stadio e di metodi di indagine molecolare e genetica altamente sviluppati. La mia analisi è consistita nella dissezione genetica, molecolare e citologica di due gruppi di mutanti maschio-sterili di Drosophila: quelli che non complementano twine e quelli che, invece, lo complementano. Twine è un gene che risiede sul braccio sinistro del cromosoma 2 e codifica per una fosfatasi responsabile dell’attivazione del complesso Cdc2-CiclinaB, alla base dell’entrata in meiosi. La mutazione a perdita di funzione tweHB5 rende gli spermatociti primari incapaci di eseguire entrambe le divisioni meiotiche, permettendo tuttavia un certo differenziamento degli spermatidi. Il fenotipo che ne risulta è, comunque, sterile in quanto gli spermatozoi prodotti non sono mobili. Il gruppo di mutazioni recessive maschio-sterili, indotte da EMS, sul quale ho concentrato la mia ricerca, mostrava un fenotipo simile a quello dei mutanti tweHB5, suggerendo, quindi, la possibilità che tali mutazioni fossero alleli del gene twine. Esperimenti di mappatura per ricombinazione meiotica insieme al sequenziamento della regione twine nel genoma dei mutanti 12-228, 60-40 e 54-23, hanno suggerito la presenza di due mutazioni sul cromosoma 2 di questi mutanti, selezionate per il fenotipo maschio sterile: una responsabile della sterilità maschile e l’altra a carico della sequenza genica di twine, alla quale si deve il fenotipo meiotico. I risultati appena menzionati erano anche supportati dai dati di “ripulitura” del cromosoma 2 eseguita in questi mutanti mediante ricombinazione meiotica. Diversi erano i risultati ottenuti dallo stock 50-38, ovvero un’altra mutazione che non complementa twine. In questo caso, i dati di mappatura per ricombinazione e del sequenziamento di twine, insieme a quelli ottenuti dalla “ripulitura” del cromosoma, indicavano la presenza di una singola mutazione sul cromosoma 2 di questi mutanti, molto vicina al gene twine, che determina sia il fenotipo maschio-sterile che meiotico. Una dettagliata analisi citologica di questo mutante attraverso anticorpi in grado di rilevare alcuni componenti chiave del ciclo cellulare meiotico, quali la α-tubulina per il fuso meiotico, la lamina per la membrana nucleare ed Spd2 per i centrosomi, evidenziava l’incapacità, da un lato, di disassemblaggio della membrana nucleare e, dall’altro, di assemblaggio del fuso meiotico, oltre a difetti nel numero e nella localizzazione dei centrosomi negli spermatociti primari. Tali anomalie sono alla base della mancata esecuzione di entrambe le divisioni meiotiche nei maschi mutanti 50-38. La caratterizzazione citologica mostrava anche difetti durante gli stadi tardivi della spermatogenesi, consistenti nella errata localizzazione del corpo basale, che impedisce di eseguire una corretta polarizzazione della cisti. Tra le mutazioni che complementano twine, una, chiamata 71-43, risultava estremamente interessante per via delle seguenti caratteristiche. I risultati della mappatura genica, effettuata sia tramite ricombinazione meiotica che attraverso l’uso di deficienze, e della “ripulitura” del cromosoma, posizionavano la mutazione 71-43 sulla porzione distale del braccio destro del cromosoma 2 come unica mutazione presente su tale cromosoma, a cui si deve il fenotipo meiotico e maschio-sterile. La dissezione citologica del processo della spermatogenesi, eseguita per mezzo di anticorpi, ha permesso di riscontrare la presenza, in questi mutanti, di anomalie a partire dai primi stadi della spermatogenesi fino a quelli più tardivi. In particolare, gli esperimenti di immunofluorescenza hanno evidenziato dei difetti di membrana nucleare, di centrosomi e di fuso meiotico nelle prime fasi dello sviluppo delle cellule germinali maschili così come aberrazioni nei processi che caratterizzano le fasi finali del differenziamento degli spermatidi, quali l’ancoraggio nucleo-corpo basale, la polarizzazione delle cisti e l’individualizzazione degli spermatozoi. L’incapacità di assemblaggio di un canonico macchinario del ciclo cellulare meiotico giustificava l’esecuzione di una sola divisione meiotica, peraltro non corretta, nei mutanti 71-43. Femmine mutanti 71-43 mostravano ridotta fertilità, indicando quindi che la funzione espletata da questo gene nell’oogenesi è probabilmente ridondante. Un indice mitotico inferiore nei cervelli larvali dei mutanti rispetto a quello dei selvatici ha suggerito, inoltre, che 71-43 agisce anche in mitosi, sebbene la sua azione sembrerebbe essere dispensabile, in quanto né ritardato sviluppo né letalità sono visibili. Differenti approcci, basati sia su metodi genetici classici che innovativi, sono stati seguiti verso l’identificazione molecolare del gene mutato nel ceppo 71-43. L’analisi per complementazione di maschi eterozigoti per la mutazione 71-43 ed un allele mutato della maggior parte dei geni che risiedono nella regione in cui il locus 71-43 mappa, ha permesso di scartare tutti quelli finora testati come potenziali candidati per tale locus. L’approccio proteomico, fondato sullo studio comparativo dei profili di espressione proteica dei testicoli degli omozigoti 71-43 vs gli eterozigoti, ha mostrato l’esistenza di alcune proteine misregolate nei mutanti 71-43, i cui geni, comunque, risiedono al di fuori dell’intervallo genico di 71-43. Tale analisi ha fornito, tuttavia, intriganti indizi riguardo ai putativi processi in cui il gene 71-43 può agire e, quindi, nuove strade da percorrere.Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellular