Etude structure-fonction d'une fucosyltransférase (FucTA) de Arabidopsis thaliana

Ce travail cherche à apporter un éclairage sur les relations séquence-structure-fonction des alpha1,3/4-fucosyltransférases, avec un accent particulier sur les core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes. La fucosylation de type Core alpha1,3 est une caractéristique des oligosaccharides N-liés des plantes et invertébrés, avec une fonction biologique qui n'est pas encore élucidée. L'activité Core alpha1,3-fucosyltransférase est responsable d'allergies alimentaires, au pollen, et aux insectes chez l'homme. Dans le cadre de ce travail sont présentés des résultats de caractérisation biochimique (effet de cations divalents sur l'activité, Km de substrat donneur), des expériences de troncation des différents domaines (ex: suppression du domaine C-terminal spécifique aux core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes), et de mutagenèse dirigée, en utilisant comme protéine modèle, la core 1,3-fucosyltransferase A (FucTA) d'Arabidopsis thaliana qui a été exprimée sous forme recombinante chez Pichia pastoris. Ces expériences ont été dictées sur la base de nos résultats d'analyses bioinformatiques des séquences de alpha1,3/4-fucosyltransférases et de la modélisation par homologie du domaine de liaison au nucléotide-sucre de l'enzyme FucTA. La mutagenèse des résidus clé identifiés par cette approche a permis de confirmer l'importance de certains acides aminés dans le mécanisme catalytique. Enfin la protéine FucTA étant elle-même glycosylée quand elle est produite chez P. pastoris, nous avons étudié l'impact de cette glycosylation sur la production et l'activité de la protéine, par des expériences de mutagenèse, de Western blotting et de spectrométrie de masse.This work brings an insight on conserved motifs and sequence similarities of alpha1,3/4-fucosyltransferases with emphasis on plant core alpha1,3-fucosyltransferases. Core alpha1,3-fucosylation is a conserved feature of plant and invertebrate N-linked oligosaccharides with no yet known biological function. Core alpha1,3-fucosyltransferase activity is connected to pollen, food and insect allergies in many patients. Core alpha1,3-fucose is recognised by the immune system as foreign element, since mammals do not produce this epitope. I present the results of biochemical characterisation (such as divalent metal ion dependency and Km for the donor substrate), protein truncation (deletion of the proposed most C-terminal subdomain unique to plant core alpha1,3-fucosyltransferases), protein fusions (of immuno-detection epitopes and His-tag), and site-directed mutagenesis of Arabidopsis thaliana core alpha1,3-fucosyltransferase A (FucTA). Mutagenesis was carried out by alanine replacement of potentially important residues based on our results of bioinformatics analyses and homology modelling (which is also subject of this work). Alanine screening was performed either to investigate the importance of some residues of the donor substrate binding pocket of A. thaliana FucTA or its putative N-glycosylation sites. The latter study was complemented also with mass spectral fingerprinting.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF