Fucosylation and defucosylation of cell wall compounds in Arabidopsis thaliana

Das Thema dieser Arbeit umfasst Xyloglucane and Rhamnogalaturonan II (RG-II). Beide sind fucosylierte Bestandteile der Zellwand und spielen eine wichtige Rolle während der pflanzlichen Entwicklung. Das Ziel bei Xyloglucanen war ein besseres Verständnis ihrer Modifikationen oder Abbau zu erhalten. Ein spezifischer Aspekt betraf Informationen über Enzyme, die bei der Entfernung von L-Fucose beteiligt sind. AtFUC95A und AtFXG1 wurden beide als Xyloglucan-spezifische 1,2-Fucosidasen publiziert (de La Torre et al., 2002; Léonard et al., 2008), obwohl sie phylogenetisch nicht verwandt sind. Wir konnten zeigen, dass beide Enzyme unterschiedliche Substrataktivitäten aufweisen. Analysen von Arabidopsis Knockout Mutanten zeigten, dass die Mutante für AtFXG1 ein ähnliches Xyloglucan-Muster wie der Wildtype besaß, während die AtFUC95A Mutante einen Anstieg an fucosylierten Polysacchariden aufwies, wie man sie bei der Inaktivierung des De-Fucosylierungsprozesses erwarten kann. Beide Gene wurden rekombinant in Nicotiana benthamiana Blättern exprimiert und in in vitro Aktivitätsassays analysiert. AtFUC95A war aktiv gegen das Oligosaccharid XXFG, jedoch nicht AtFXG1. Wir konnten einen Hinweis über die mögliche Funktion von AtFXG1 finden, wobei wir vorschlagen dass es sich um eine Esterase handelt. Es wurden auch die zelluläre Lokalsierung von AtFUC95A sowie die Expression in verschiedenen Organen der Pflanze durchgeführt. Hinsichtlich RG-II charakterisierten wir die strukturelle Varietät, die sich als viel höher darstellte als bis jetzt beschrieben. Um ein besseres Verständnis der Biosynthese dieses Polysaccharides zu erhalten wurde versucht, Fucosyltransferasen mit einer spezifischen Aktivität an RG-II zu identifizieren. Zusätzlich generierten und analysierten wir Pflanzen, welche im GDP-L-Fucose oder GDP-L-Galactose Biosyntheseweg defekt sind. Die Unterdrückung des Schlüsselenzyms, welches im GDP-L-Galactose Biosyntheseweg involviert ist, führt zu einer starken Reduktion von L-Galactose an RG-II, stört allerdings nicht die pflanzliche Entwicklung, selbst wenn ein Knockout des betreffenden Genes letal ist. Die Unterdrückung des GDP- L-Fucose Biosynthesewegs beeinflusste die Biosynthese der Seitenkette A mehr als bisher beschrieben und brachte uns dazu, die Gründe für den Phänotyp dieser viel untersuchten Mutante neu zu bewerten.Xyloglucans and rhamnogalacturonan II (RG-II) constitute the subject of research of this work. Both are fucosylated cell wall compounds playing crucial roles in plant development. On the front of xyloglucans, the aim was to better understand their modification or degradation, and more specifically to get information on enzyme(s) responsible for the removal of the L-fucose residue present on this polysaccharide. AtFUC95A and AtFXG1 have both been published as xyloglucan-specific 1,2-fucosidases (de La Torre et al., 2002; Léonard et al., 2008), even though they are phylogenetically not related. In this work we could show that both enzymes possess different activities. Analysis of Arabidopsis knockout mutants of both genes revealed that the knockout plants for AtFXG1 have a similar xyloglucan pattern as wiltype, whereas AtFUC95A knockout plants show an increase in the degree of fucosylation of this polysaccharide compatible with the inactivation of a defucosylation process. Both genes were expressed recombinantly in Nicotiana benthamiana leaves and analysed by in vitro activity assays. AtFUC95A was active against the oligosaccharide XXFG whereas AtFXG1 was not active. Furthermore, we could find a hint about the potential function of AtFXG1, which we propose to be an esterase. The subcellular localisation of AtFUC95A in the apoplast and the expression of its gene in the different organs of the plant were realised. Concerning RG-II, we characterised its structural diversity, which is much higher than described until now. To gain a better understanding on the biosynthesis of this polysaccharide, attempts were made to identify the fucosyltransferases specifically acting on RG-II. In addition, we generated and analysed plants defective in GDP-L-fucose or GDP-L-galactose biosynthesis. The suppression of the key enzyme involved in GDP-L-galactose biosynthesis, leads to a strong reduction of the presence of L-galactose on RG-II but does not disturb the plant development, even though a knocking out of the corresponding gene is lethal. Suppression of GDP- L-fucose biosynthesis affects much more side chain A biosynthesis than previously described and drive us to re-evaluate the reason leading to the phenotype of this highly studied mutant.submitted by Richard Michael FischlAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2011OeBB(VLID)193074