NMR studies on the isolated C39 peptidase-like domain of ABC transporter Haemolysin B from $\textit{E. coli}$: Investigation of the solution structure and the binding interface with HlyA

Membranen, bestehend aus einer Lipiddoppelschicht, bilden ubiquitäre Barrieren in biologischen Systemen. Ihre Hauptaufgaben sind Schutz und Abgrenzung. Damit Moleküle diese Barrieren überwinden können, entwickelten sich spezialisierte Transmembranproteine. Sie sind für den selektiven und gerichteten Transport von Makromolekülen verantwortlich. Eine Untergruppe, welche aktiv gegen Konzentrationsgradienten transportieren kann, sind ABC-Transporter. Diese aktiven Transporter verwenden die Energie aus der Hydrolyse von ATP, um den Transport der Substrate anzutreiben. Dabei reicht ihr Substratspektrum von einzelnen Ionen bis zu Proteinen von einigen hundert kDa Größe. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Haemolysin-Typ-I-Sekretionssystem aus $\textit{Escherichia coli}$ mit dem zentralen ABC-Transporter HlyB. Im Verbund mit dem $\textit{outer membrane}$ Protein TolC, einem Tunnel-artigem Protein der äußeren Membran, welches durch das gesamte Periplasma reicht, und dem $\textit{membrane fusion}$ Protein HlyD wird ein Translokationskomplex gebildet. Diese System ist geeignet das 110 kDa Toxin HlyA in einem kontinuierlichen Prozess aus dem Zytosol in das umgebende Milieu zu sekretieren. Mehrere Studien über den gesamten Komplex und seinen isolierten Substrukturen, als auch über die Sekretion von HlyA wurden durchgeführt, was zu einem umfassenden Wissen über dieses System führte. Bisher lag der Fokus der Forschung jedoch nicht auf der C39 Peptidase-ähnlichen Domäne. Daher war es Ziel dieser Arbeit, deren Lösungsstruktur NMR-spektroskopisch aufzuklären und die mögliche Interaktion zwischen dem Toxin HlyA und der C39-ähnlichen Domäne von HlyB zu untersuchen. Für die Untersuchungen wurde der$\textit{divide and conquer}$ Ansatz gewählt und die isolierte Domäne untersucht. Ein Expressions und Reinigungsprotokoll wurde entwickelt, welches eine Produktion von 15 mg reiner [U-$^{15}$N,$^{13}$C]-C39-ähnlicher Domäne pro Liter Expressionskultur erlaubt. Weitere Optimierungen des Expressionskonstruktes und der Lösungsbedingungen wurden durchgeführt, welche in Schwarz et al. (2011) beschrieben sind. Auf Grund welcher es möglich wurde Proteinkonzentrationen von 3 mM zu erreichen und das Protein in Lösung über Monate zu stabilisieren, was wiederum die Aufnahme von multidimensionalen NMR-Datensätzen erlaubte. Nahezudie gesamte Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrades (99%) und der Aminosäureseitenketten (97%) konnte erreicht werden und sind in der BMRB hinterlegt. Diese Ergebnisse wurden in Lecher et al. (2011) publiziert. Alle nachfolgenden Ergebnisse sind im Manuskript $\textit{Initial recognition steps of the type I secretion system}$: Lecher und Schwarz, et al. zusammengefasst. Ein Hauptziel der Forschung war die Bestimmung der Lösungsstruktur von der C39-ähnlichen Domäne. Hierzu wurden 3D-NOESY Spektren bei hoher magnetischer Feldstärke aufgenommen. Ihre Auswertung ergab die hohe Anzahl von durchschnittlich 30 Distanzeinschränkungen pro Aminosäurerest, was eine zuverlässige Bestimmung der [...