Strategien zur strukturellen Charakterisierung alpha-helikaler Membranproteine mittels zellfreier Expression und NMR Spektroskopie : eine Anwendung auf Proteorhodopsin

Membrane proteins (MPs) constitute about 30% of the genome and are essential in many cellular processes. In particular structural characterisation of MPs is challenged by their hydrophobic nature resulting in expression difficulties and structural instability upon extraction from the membrane. Despite these challenges, progress in sample preparation and the techniques to solve MP structures has led to 281 unique MP structures as of January 2011. Through the combination of a cell-free expression system and selective labelling strategies, this thesis aimed to advance the structure determination of α-helical MPs by NMR spectroscopy and resulted in the structure determination of a seven-ransmembrane-helix protein. Results were obtained for the 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) and proteorhodopsin (PR). The detergent-based cell-free expression mode proved most efficient for production of both targets, but optimisation of FLAP and PR followed different routes. The presence of a retinal cofactor in PR greatly facilitated the search for an appropriate hydrophobic environment. For structural studies, NMR spectra of FLAP indicated favourable properties of the lysolipid LPPG. In contrast, PR was stable and homogenous in the short-chain lipid diC7PC. As NMR spectra of α-helical MPs are generally characterised by broad lines and signal overlap, selective labelling strategies were essential in the assignment process of both targets. For the backbone assignment of FLAP the transmembrane segment-enhanced (TMS) labelling was developed, employing the six amino acids AFGILV. These residues cluster predominantly in transmembrane helices and form long stretches allowing a large extent of backbone assignment. Besides that, the combinatorial labelling enables identification of unique pairs in the sequence based on a mixture of 15N and 1-13C-labelled amino acids. To find the optimal labelling pattern for a given primary structure, the UPLABEL algorithm has been made available and successfully applied in the backbone assignment of PR. Both selective labelling approaches greatly benefitted from the use of a cell-free expression system to reduce isotope scrambling. Additionally, the de novo structure of PR was determined with an average backbone rmsd of 1.2 Å based on TALOS-derived backbone torsion angles, intrahelical hydrogen bond restraints and distance restraints from the NOE and paramagnetic relaxation enhancement (PRE). A major bottleneck in the NMR structure determination of MPs concerns the number of long-range distances which are often limited. In PR, side chain assignment was enabled by stereo-array isotope labelling as well as selective labelling which provided 33 long-range NOEs. These NOEs stabilised the symmetry of the seven helix bundle. With a total number of 1031, the majority of long-range distances were derived from PREs. The structure of PR reveals differences to its homologues such as the absence of an anti-parallel β-sheet between helices B and C and allows conclusions towards the mechanism of colour tuning.Ziel dieser Arbeit ist, Strategien zur Strukturaufklärung α-helikaler Membranproteine mittels NMR Spektroskopie weiter zu entwickeln und so das Spektrum möglicher Zielproteine zu erweitern. Auf Basis eines zellfreien Expressionssystems wurden Methoden zur selektiven Isotopenmarkierung erarbeitet und die drei-dimensionale Struktur einen Sieben-Transmembran-Helix Proteins bestimmt. Membranproteine spielen eine essentielle Rolle in vielen zellulären Prozessen wie dem Membrantransport, der Signaltransduktion oder in Zell-Zell Kontakten. Sie sind daher wichtige Zielproteine für die Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe. Um Wirkstoffe gezielter einzusetzen und sie zu verbessern, ist ein tiefgreifendes Verständnis dieser Proteine erforderlich. Die funktionelle und strukturelle Erforschung von Membranproteinen ist jedoch durch deren hydrophoben Eigenschaften erschwert. Hierbei kommt es zu Expressionsschwierigkeiten und einer erhöhten Instabilität der Proteine außerhalb der Zellmembran. Dies betrifft insbesondere Proteine mit überwiegend α-helikaler Sekundärstruktur, welche die Mehrheit der Membranproteine darstellen. Vor allem für die Strukturanalyse werden große Mengen an stabilem und homogenem Protein benötigt. Nichts desto trotz gelang es in den vergangenen Jahren einige Strukturen helikaler Membranproteine einschließlich G-Protein gekoppelter Rezeptoren aufzuklären. Dieser Erfolg lässt sich zurückführen auf Verbesserungen bei der Probenherstellung sowie auf technische Forschritte der Methoden zur Strukturaufklärung. Nur einige wenige Membranproteine liegen in hohen zellulären Konzentrationen vor, während der Großteil der Zielproteine hingegen heterolog exprimiert werden muss. Bakterielle Expression in E. coli bietet hierfür ein breites Methodenspektrum. Höhere Expressionssysteme sind aber vor allem bei eukaryotischen Proteinen vielversprechend. So ermöglichte beispielsweise die Insektenzell-Expression in Sf9 Zellen die Strukturaufklärung des β2-Adrenergen Rezeptors (1). Eine alternative Methode zur Herstellung ausreichender Mengen Membranprotein ist die zellfreie Expression. Dieses offene System ermöglicht eine direkte Kontrolle des Reaktionsprotokolls und eröffnet somit verschiedene Modi zur Expression von Membranproteinen entweder in Anwesenheit von Detergenz oder Lipid oder gänzlich ohne hydrophobe Umgebung. Wird keine hydrophobe Umgebung zugesetzt, präzipitiert das Zielprotein. Dieses Präzipitat unterscheidet sich jedoch von den Einschlusskörpern in E. coli und lässt sich in relativ milden Detergenzien resolubilisieren. Die Anwesenheit von Detergenz in der zellfreien Reaktion erlaubt die lösliche Expression des Proteins und als dritte Option besteht die Möglichkeit eines Lipid-basierten Expressionsmodus. Auf diese Weise ergeben sich vielfältige Wege zur Optimierung des Zielproteins. Einen großen Vorteil bietet das zellfreie Expressionssystem hinsichtlich der Verwendung markierter oder unnatürlicher Aminosäuren. Dies gilt vor allem für die NMR Spektroskopie, denn isotopenmarkierte Aminosäuren werden nur bedingt in andere Aminosäuren konvertiert. .