Effect of anti-inflammatory dendrimers on the pathogenesis of multiple sclerosis

Inflammation is required for efficient clearance of infections and repair of injured tissue. However, dysregulated inflammation contributes to the pathogenesis of major peripheral and CNS diseases. Multiple sclerosis (MS), one of the most common neurological disorders in young adults, is an autoimmune disease affecting the CNS with an important inflammatory component that leads to demyelination and diffuse neurodegeneration. During the last years, a significant number of new treatments have been approved by the regulatory agencies. However, none of them is able to reverse the disease progression. They have limited long-term effectiveness and produce significant side-effects. Therefore, new therapies are required for treating MS and those that have an inflammatory component in their pathophysiology. Currently, one of the most active research fields is the quest for new treatments is nanomedicine. Within this field, dendrimers and, within them, phosphorous dendrimers are one of the most promising nanoparticles for biomedical applications. Their stability, multifunctionality and possibility to be synthesized under GMP conditions make them suitable candidates to be studied in different pathologies including autoimmune diseases such as MS and rheumatoid arthritis. This doctoral thesis focuses on the study of the anti-inflammatory properties of two new neutral phosphorous dendrimers (G3bis and G4bis) on MS pathogenesis. G3bis and G4bis did not show toxicity on astrocytes, cortical neurons and peritoneal macrophages in mice and neither on human monocytes under the conditions studied. However, both dendrimers reduced the proliferation of mouse thymus and spleen lymphocytes, whereas no effect on human lymphocytes was observed. In the initial phases of MS, peripheral and resident macrophages participate in the induction and development of the disease, playing a dual role in the pathogenesis depending on the phenotype: M1 population with an acute pro-inflammatory phenotype and M2 population with an anti-inflammatory role. Both phosphorous dendrimers reduced LPS-induced CD86 and iNOS expression, and decreased nitrite levels, as well as, pro-inflammatory cytokines release such as TNF-? and IL-1? from both mouse peritoneal macrophages and human monocytes. These results suggest that the dendrimers inhibited macrophage M1 polarization. Moreover, both dendrimers enhanced secretion of IL-4 and increased CD163 expression as markers for the M2 population. Taken together, these results indicate that G3bis and G4bis phosphorous dendrimers switch polarization of mouse peritoneal macrophages from a M1 pro-inflammatory phenotype to a M2 anti-inflammatory phenotype. In addition, while G3bis and G4bis produced a generalized reduction in the secretion of all cytokines studied from mouse lymphocytes, probably due to the reduction of the proliferation rate, in the case of human lymphocytes only the secretion of the main pro-inflammatory cytokines was reduced. The molecular mechanism of action beneath the anti-inflammatory effect of G3bis and G4bis seems to be related to an inhibition of the NFkB pathway activation, by preventing NFkB translocation from cytosol to nucleus. Later studies found that the dendrimers might act inhibiting the proteasome activity, and avoiding IkB degradation. After identifying the mechanism of action of the phosphorous dendrimers, we studied whether these nanoparticles also displayed an anti-inflammatory profile in two models of inflammation in vivo. On the one hand, we studied the effect of phosphorous dendrimers on a sub-chronic model of inflammation, the mouse air pouch. Our results suggested that G3bis and G4bis showed a marked anti-inflammatory activity through preventing macrophages polarization to M1 state and returning the balance M1/M2 toward a non-inflammatory situation. On the other hand, we also evaluated the effect of G3bis and G4bis on a murine model of multiple sclerosis, the EAE. The induction of EAE caused an increase in the disability score up to 2.5-3 that was prevented by both phosphorous dendrimers with a similar extension than the gold standard treatment fingolimod. Finally, we studied the pharmacokinetic and biodistribution of the phosphorous dendrimers. The results showed G3bis-8Pt followed a two-compartment model and accumulated in reticuloendothelial organs. Taking together, our findings suggest that G3 and G4 phosphorous dendrimers present a good anti-inflammatory profile that might be useful for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases. However, it is still necessary to evaluate the long-term toxicity as well as to determine its effect on other cell types involved in the pathogenesis of those diseases. La respuesta inflamatoria es necesaria para la correcta eliminación de infecciones y la reparación del tejido lesionado. Sin embargo, una desregulación en dicha respuesta contribuye a la patogénesis de las principales enfermedades periféricas y del SNC. La esclerosis múltiple (EM), uno de los trastornos neurológicos más comunes en adultos jóvenes, es una enfermedad autoinmune que afecta el SNC con un importante componente inflamatorio y que conduce a la desmielinización y la neurodegeneración difusa. Durante los últimos años, las agencias reguladoras han aprobado un significativo número de nuevos tratamientos. Sin embargo, ninguno de ellos es capaz de revertir la progresión de la enfermedad, poseen además una efectividad limitada a largo plazo y producen efectos secundarios significativos. Por lo tanto, se requieren nuevas terapias para tratar tanto la EM como aquellas que tienen un componente inflamatorio en su fisiopatología. Actualmente, uno de los campos de investigación más activos en la búsqueda de nuevos tratamientos es la nanomedicina. Dentro de este campo, los dendrímeros y, dentro de ellos, los fosfodendrímeros son una de las nanopartículas más prometedoras en aplicaciones biomédicas. Su estabilidad, multifuncionalidad y la posibilidad de sintetizarse en condiciones de GMP los hacen candidatos adecuados para ser estudiados en diferentes patologías, incluidas las enfermedades autoinmunes como la EM y la artritis reumatoide. Esta tesis doctoral se centra en el estudio de las propiedades antiinflamatorias de dos nuevos fosfodendrímeros neutros (G3bis y G4bis) en la patogénesis de la EM. G3bis y G4bis no mostraron toxicidad en astrocitos, neuronas corticales y macrófagos peritoneales en ratones y tampoco en monocitos humanos en las condiciones estudiadas. Sin embargo, ambos dendrímeros redujeron la proliferación de linfocitos de timo y bazo de ratón, mientras que no se observó ningún efecto sobre los linfocitos humanos. En las fases iniciales de la EM, los macrófagos periféricos y residentes participan en la inducción y el desarrollo de la enfermedad, desempeñando un doble papel en la patogénesis según el fenotipo: la población M1 con un fenotipo proinflamatorio agudo y la población M2 con un papel antiinflamatorio. Ambos fosfodendrímeros redujeron la expresión de CD86 e iNOS inducida por LPS, y disminuyeron los niveles de nitritos, así como la liberación de citocinas proinflamatorias como TNF-? e IL-1? de macrófagos peritoneales de ratón y monocitos humanos. Estos resultados sugieren que los dendrímeros inhibieron la polarización de macrófagos hacia la población M1. Además, ambos dendrímeros aumentaron la secreción de IL-4 y aumentaron la expresión de CD163 como marcadores para la población M2. Estos resultados nos indican que los fosfodendrímeros G3bis y G4bis cambian la polarización de los macrófagos peritoneales de ratón de un fenotipo proinflamatorio M1 hacia un fenotipo antiinflamatorio M2. Además, mientras que G3bis y G4bis produjeron una reducción generalizada en la secreción de todas las citocinas estudiadas a partir de linfocitos de ratón, probablemente debido a la reducción de la tasa de proliferación, en el caso de los linfocitos humanos solo se redujo la secreción de las principales citocinas proinflamatorias. El mecanismo de acción molecular responsable del efecto antiinflamatorio de G3bis y G4bis parece estar relacionado con una inhibición de la activación de la vía NFkB, al evitar la translocación de dicho factor de transcripción del citosol al núcleo. Posteriores estudios encontraron que los dendrímeros podrían actuar inhibiendo la actividad del proteasoma y evitando la degradación de IkB. Después de identificar el mecanismo de acción de los fosfodendrímeros, estudiamos si estas nanopartículas también mostraban un perfil antiinflamatorio en dos modelos de inflamación in vivo. Por un lado, estudiamos el efecto de los fosfodendrímeros en un modelo subcrónico de inflamación, la bolsa de aire del ratón. Nuestros resultados sugirieron que G3bis y G4bis mostraron una marcada actividad antiinflamatoria al evitar la polarización de los macrófagos al estado M1 y restaurar el equilibrio M1 / M2 hacia una situación no inflamatoria. Por otro lado, también evaluamos el efecto de G3bis y G4bis en un modelo murino de esclerosis múltiple, el EAE. La inducción de EAE causó un aumento en la escala de discapacidad de hasta 2.5-3 que fue evitado por ambos fosfodendrímeros con una extensión similar al tratamiento estándar fingolimod. Finalmente, estudiamos la farmacocinética y la biodistribución de los fosfodendrímeros. Los resultados mostraron que G3bis-8Pt siguió un modelo bicompartimental y se acumuló en los órganos reticuloendoteliales. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que los fosfodendrímeros G3 y G4 presentan un buen perfil antiinflamatorio que podría ser útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Sin embargo, aún es necesario evaluar la toxicidad a largo plazo, así como determinar su efecto sobre otros tipos de células involucradas en la patogénesis de esas enfermedades