The role of signaling lipids in the nervous system physiology and pathology: mechanistic insights of the phospholipase D pathway in neurodegenerative diseases

Tese de Doutoramento em Envelhecimento e Doenças CrónicasLipids are a major constituent of the brain and, more specifically, signaling lipids have been shown to regulate brain functioning. Moreover, lipid signaling modulation has been demonstrated to be a potential therapeutic option for neurological disorders, such as Alzheimer’s disease (AD). AD is the most common neurodegenerative disease and currently there is no effective treatment to tackle its progression. Therefore, a detailed understanding of its pathogenesis is critical to envision new therapeutic strategies. The main hallmarks of AD are the accumulation of amyloid-beta (Aβ) and impaired phosphorylation of tau. Growing evidence suggests that a group of enzymes called phospholipases, that modulate the metabolism of signaling lipids, have an impact in neuronal physiology, including membrane trafficking processes. The lipid modifying phospholipase D (PLD) isoenzymes, PLD1 and PLD2, were shown to affect endocytosis and membrane trafficking, as well as modulate AD-related signaling pathways. Moreover, Aβ was reported to increase both isoenzymes’ activity in primary neuronal cultures and in an AD mouse model. Despite this, the precise role of PLD enzymes in AD pathology is poorly understood. We envisioned a multidisciplinary approach using neuronal cell lines, nematode and AD mouse models for further characterization of the role of the PLD pathway in neurodegenerative diseases. While we found that ablation of PLD has no important effect in worm behavior, its ablation in an AD-like model that overexpresses mutated Aβ markedly improves various of its phenotypes. Additionally, we showed that PLD enzymes and tau interact and that PLD overexpression leads to decreased tau levels in a cell line model. Remarkably, PLD ablation in a C. elegans tauopathy-like model led to an increase in tau levels and marked improvement of various of its phenotypes. We also found that tau interacts with several phospholipids, such as phosphatidic acid, the product of PLD enzymatic activity. Collectively, our results support PLD as a downstream pathway of Aβ interaction with membranes, identifies the PLD pathway as a key regulator of tau physiology and pathology and confirms PLD as an important player in neurodegeneration in tauopathy disease models. To further address the role of PLD pathway as a key regulator in neurodegenerative diseases, future studies should be performed to dissect the mechanism underlying its neuroprotective effect. Furthermore, it has been shown that AD patients are more susceptible to seizure-like activity and have a higher rate of epileptiform/sub-epileptic events. The use of AD mouse models (hAPP) mice, with Aβ overproduction, replicates many of the human disease hallmarks, such as memory deficits and susceptibility to pharmacological induced seizures. Concerning AD pathogenesis, it has been shown that specific lipid signatures have been identified both in human and mouse AD brain samples, showing that lipid metabolism is indeed dysregulated. We characterized the hippocampal lipidome of hAPP mice in the context of pharmacologically-induced seizures. With our unbiased lipidomic approach, we observed overall major lipid changes in hAPP mice in line with previous reports. Importantly, lipid profiling of the hAPP mouse brain hippocampus in the context of pharmacologically-induced seizures allowed for the identification of the dysregulated lipid pathways, revealing putative targets for pharmacological intervention that may potentially be used to protect from excitotoxicity in an AD context. In summary, our work further suggests that PLD is a potential therapeutic target for neurodegenerative diseases and support the notion that lipid signaling is a promising target for pharmacological intervention in excitotoxicity pathological diseases.Os lípidos são componentes essenciais do cérebro, e especificamente os lípidos de sinalização regulam o seu funcionamento. Estudos revelam que, a modulação da sinalização lipídica demonstrou ser uma potencial estratégia terapêutica para distúrbios neurológicos, como a doença de Alzheimer (DA). DA é a doença neurodegenerativa mais comum e, atualmente, não existem tratamentos eficazes para enfrentar o seu avanço clínico. Assim, uma compreensão detalhada da sua patogénese é fundamental para encontrar novos alvos terapêuticos. A DA é caracterizada patologicamente pela acumulação de amilóide-beta (Aβ) e hiperfosforilação da proteína tau. Trabalhos anteriores sugerem que um grupo de enzimas chamadas fosfolipases, que modulam os lípidos de sinalização, têm um impacto na fisiologia neuronal, incluindo nos processos de tráfego membranar. As isoenzimas da fosfolipase D (PLD) que modificam lípidos, PLD1 e PLD2, afetam a endocitose e o tráfico membranar e modulam as vias de sinalização relacionadas a DA. Curiosamente, foi demostrado que a Aβ aumenta a atividade de ambas as isoenzimas em culturas primárias de modelos de ratinho, que expressam o gene humano que codifica a proteína precursora da amilóide (APP). Contudo, o papel preciso das enzimas PLD na patologia da DA continua mal compreendido. Neste trabalho de investigação optámos por uma estratégia holística que envolveu o uso de linhas celulares neuronais, nemátodes e modelos de ratinho com DA para uma caracterização adicional do papel da via da PLD em doenças neurodegenerativas. Embora a ablação da PLD não tenha um efeito notório no comportamento dos nemátodes, a sua ablação num modelo “DA-like” que sobreexpressa Aβ melhora marcadamente vários fenótipos. Adicionalmente, observámos que ambas as enzimas PLD interagem fisicamente com a tau e que a sobre-expressão da PLD leva a uma forte diminuição dos níveis de tau em células. O nosso estudo também revelou que a ablação da PLD num modelo de tauopatia em C. elegans leva a um aumento nos níveis de tau e marcadamente a uma melhoria de vários fenótipos. Também observámos que, supreendentemente a tau interage com os fosfolípidos como por exemplo, o ácido fosfatídico, produto da actividade enzimática da PLD. Coletivamente, os nossos resultados suportam a PLD como uma via “downstream” da interação Aβ com membranas, identificámos a via PLD como um regulador chave da fisiologia e patologia da tau e corroborámos os estudos anteriores que apontam a PLD como crucial na neurodegeneração em modelos de tauopatia. Estudos futuros necessitam de ser realizados para abordar com maior detalhe o papel da via PLD como regulador chave em doenças neurodegenerativas. Estudos anteriores revelaram que, os doentes com DA são mais susceptíveis a convulsões e têm uma maior taxa de eventos epileptiformes/subepilépticos. O uso de modelos de ratinho DA (hAPP), que sobre-expressam amyloid-beta (Aβ) replicam muitas das características da doença humana, como défices de memória e susceptibilidade excitotóxica. No que diz respeito à patogénese da DA, verificou-se que assinaturas metabólicas lipídicas específicas foram identificadas tanto em amostras de cérebro de DA humanas quanto em ratinhos, demonstrando que o metabolismo lipídico está realmente desregulado. Caracterizámos o lipidoma do hipocampo de ratinhos hAPP no contexto de convulsões induzidas farmacologicamente. Esta análise lipídica mostra alterações globais de lípidos em ratinhos hAPP. De realçar que o perfil lipídico do hipocampo do cérebro do ratinho hAPP no contexto de convulsões induzidas pelo pentylenetetrazole (PTZ) permitiu a identificação de vias lipídicas desreguladas, revelando potenciais alvos terapêuticos que podem ser utilizados para proteger da excitotoxicidade num contexto de DA.The work presented in this thesis was performed in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), University of Minho, Braga and Chronic Diseases Research Centre, NOVA Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa, Lisboa. The author was financial supported by a grant from the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT, PD/BD/52286/2013) through the Inter-University Doctoral Programme in Ageing and Chronic Disease (PhDOC).This work was supported by FEDER funds through the Operational Programme Competitiveness Factors - COMPETE and National Funds through FCT under the project POCI-01-0145-FEDER- 007038; and by the project NORTE-01-0145-FEDER-000013, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF)