Investigation of the endogenous MHC class II-restricted presentation of nuclear antigens

Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht. Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verstärkte Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+ T-Zellüberwachung unterliegen.The endogenous presentation of intracellular antigens on major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules plays an important role in adaptive immune responses, but the underlying molecular mechanisms are not well understood. The aim of this study was to gain insight into the endogenous presentation pathways for nuclear antigens on MHC-II molecules. By using antigen-specific CD4+ T cell clones, MHC-II presentation of the nuclear antigens neomycin phosphotransferase II (NucNeoR) and Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) was studied in professional and non-professional antigen presenting cells (APC). Both types of APC presented peptides derived from these nuclear proteins on MHC-II molecules by an endogenous presentation pathway and not by release and reuptake as exogenous protein. Inhibition of autophagy drastically reduced endogenous antigen presentation, indicating that nuclear proteins enter the MHC-II processing and loading compartment through autophagic vesicles. Because autophagocytosis occurs in the cytoplasm, potential entry routes for nuclear proteins into this pathway were investigated. Endogenous presentation of NucNeoR on MHC-II molecules by autophagy did neither involve the CRM1-mediated export of the nuclear protein into the cytoplasm, nor the redistribution of nuclear and cytoplasmic components following the dissolution of the nuclear envelope during mitosis. Conditional antigen expression and cell cycle phase separation of antigen-expressing cells revealed that antigen presentation was maximal in cells in G1/0 and then gradually decreased as cells progressed in the cell cycle. This reduction in antigen presentation correlated with a cell cycle-dependent decrease in antigen transcription/translation, but not with the total amount of antigen present in these cells. By contrast, when antigen expression was turned off, antigen presentation correlated with MHC-II surface expression, which increased from G1/0- to G2/M-phase. A similar correlation between antigen presentation and antigen transcription/translation was also observed for the antigens EBNA3C and the cytosolic variant of neomycin phosphotransferase II (NeoR). These results identify autophagocytosis of newly-synthesized proteins as the molecular mechanism mediating endogenous presentation of nuclear and cytosolic antigens on MHC-II molecules. By coupling protein translation and autophagocytosis, newly-synthesized proteins gain access to the endogenous MHC-II presentation pathway irrespective of their subcellular localisation and thereby broaden the spectrum of intracellular antigens that are presented to CD4+ T cells