Characterization of antigen processing and presentation by peptide-linked MHC class I molecules

MHC-Klasse-I-Moleküle präsentieren gewöhnlich Peptide, die aus zytosolischen Antigenproteinen durch proteasomalen Verdau generiert und anschließend vom TAP-Peptidtransporter ins endoplasmatische Retikulum transportiert werden. Es können jedoch auch endozytierte Antigene für die MHC-Klasse-I-vermittelten Antigenpräsentation prozessiert werden, wobei dieser alternative Weg entweder in einer Proteasom/TAP-abhängigen oder unabhängigen Weise abläuft. Während diese so genannte „Kreuzpräsentation“ für einige exogene lösliche bzw. partikuläre Antigen beschrieben war, war zu Beginn dieser Arbeit die endolysosomale Prozessierung von MHC-Klasse-I-bindenden Peptiden aus zelleigenen, membranständigen Proteinen noch weitgehend unverstanden. In meiner Dissertation habe ich die H-2Kb-vermittelte Antigenpräsentation von Klasse-I-Peptid-Fusionsproteinen als Modellantigensystem verwendet. Ich untersuchte den alternativen, TAP-unabhängigen Prozessierungsweg in immortalisierten Fibroblasten aus TAP-defizienten bzw. Tapasin-defizienten Mäusen sowie mit Hilfe von TAP-defizienten Maus-T-Lymphomzellen. Ich verwendete das aus dem Ovalbumin stammende Kb-bindende Peptid SIINFEKL in kovalenter Verknüpfung mit dem Aminoterminus von Kb- und Kd-Klasse-I-Molekülen, wobei die SIINFEKL-Sequenz am N-terminalen Ende durch verschiedene natürlich vorkommende und artifizielle Sequenzen verlängert wurde. Ich konnte zeigen, dass das SIINFEKL-Epitop aus zahlreichen Sequenzkontexten herausprozessiert und effizient gegenüber SIINFEKL/Kb-spezifischen B3Z T-Hybridomzellen präsentiert wurde. Die Präsentation dieser Peptid-Klasse-I-Konjugate war inhibierbar durch azidophile Amine und Inhibitoren der vakuolären Protonenpumpe, welche den pH von endosomalen Vesikeln anheben. Diese Inhibition weist auf eine Antigenprozessierung im endolysosomalen Weg hin, da sowohl die Funktion von endosomalen Hydrolasen als auch der vesikuläre Transport im endozytischen Weg pH-abhängig sind. Pepstatin A als Inhibitor der endolysosomalen Endoproteasen Cathepsin E und D war ebenfalls in der Lage, die Prozessierung von SIINFEKL-Peptiden aus SIINFEKL-Kd-Konjugaten zu blockieren. Ich konnte jedoch keine Hinweise auf eine Beteiligung der ER-Aminopeptidase ERAP1 bzw. der im trans-Golgi-Netzwerk exprimierten Endoprotease Furin bei der Prozessierung unserer membranassoziierten Modellproteine finden. N-terminale Verlängerungen des SIINFEKL-Epitops und verschiedene C-terminal flankierende Aminosäuren wurden in der Regel effizient entfernt, wobei Prolin als flankierende Aminosäure einschränkend auf die Prozessierung wirkte. Bemerkenswerterweise verwenden nicht nur TAP-defiziente, sondern auch Zellen mit voll funktionsfähigem TAP-abhängigen Peptidbeladungskomplex den alternativen endosomalen Weg der Antigenprozessierung. Dieser neuartige Befund ergab sich durch die gleichfalls in Wildtypzellen vorhandene Blockade der Präsention unserer Fusionsproteine durch Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung. Darüberhinaus untersuchte ich den Mechanismus der Internalisierung der Peptid-Klasse-I-Konjugate von der Zelloberfläche. Inhibitorstudien zeigten, dass sowohl die Clathrin-abhängige wie die Clathrin-unabhängige Endozytose bei der Internalisierung der Konjugate beteiligt war. Interessanterweise spielten Sortierungssignale in der zytoplasmatischen Domäne von Klasse-I-Molekülen keine Rolle für das Erreichen von prozessierungsaktiven Kompartimenten, da diese Domäne ohne Verlust der Antigenpräsentation deletiert werden konnten. Die Rezyklierung von peptidbeladenen Kb-Molekülen aus Endosomen zur Zelloberfläche zeigte sich ebenfalls unbeeinflusst durch Signale in der zytoplasmatischen Domäne. SIINFEKL-beladene Kb-Moleküle konnten durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie in frühen und späten Endosomen nachgewiesen werden. Diese Arbeit belegt die funktionelle Relevanz eines bislang noch wenig untersuchten, alternativen Antigenpräsentationswegs, der nach Internalisierung und endosomaler Prozessierung von internalisierten, endogen synthetisierten Transmembranproteinen zur Präsentation von Antigenpeptiden auf rezyklierenden MHC-Klasse-I-Molekülen führt