Verification of inhibiting the expression of genes involved in cariogenic biofilm formation by Streptococcus mutans

Dental caries results from a metabolic imbalance in the biofilm, formed by bacteria, especially streptococci and lactobacilli. One way of preventing caries process would be inhibit cariogenic biofilm formation. This work therefore aims to verify the possible inhibition of biofilm formation by Streptococcus mutans (S. mutans) after the treatment with four substances (epigallocatechin, chlorhexidine, xylitol and resveratrol), and to investigate the action mechanism through the expression of the genes glycosyltrasferase (GTF) and fructosyltransferase (FTF). The test of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was carried out to quantify the expression of these enzymes. Cell viability assays as well as tests for verification of biofilm formation were also carried out after the treatment with the test substances to determine the concentration when the inhibition of biofilm formation occurred under conditions of cell viability.The xylitol, resveratrol and chlorhexidine concentrations that proved effective were 100 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0.001 mg/mL, respectively, concentrations in which there was inhibition of biofilm formation without modification of the bacterial viability. The epigallocatechin didn’t demonstrate a concentration that would provide biofilm inhibition without the consequent inhibition of bacterial viability. The treatments were performed with xylitol, resveratrol and chlorhexidine, and after completion of RT-qPCR (reverse transcription real time polymerase chain reaction), they’re obtained the results for enzyme expression of FTF and GTFB. There was a significant decrease (72.8%) in the enzyme FTF expression after treatment with xylitol. The resveratrol didn’t affect the expression of this enzyme and chlorhexidine caused reduced gene expression control (housekeeping gene), precluding to evaluate the FTF gene expression in the assessed concentration. There was no significant change in GTFB expression after treatment with resveratrol and chlorhexidine in defined concentrations. Xylitol reduced housekeeping gene 16S rRNA expression, indicating cell death in the concentration tested. The results led us to conclude that the three substances (resveratrol, xylitol and chlorhexidine) act as potential dental biofilm inhibitors formed by S. mutans. It was found, however, that xylitol inhibits FTF gene expression, indicating that the probable mechanism of action of such inhibition of biofilm formation was by reducing the expression of this S. mutans gene. Chlorhexidine has already recognized bactericidal action, however this work we see a concentration of this substance that was inhibiting biofilm without subsequent cell death. Considering those findings may suggest other ways of applying the xylitol and chlorhexidine in dentistry and also the use of resveratrol as an inhibitory agent of the carious process, since it is capable of inhibiting dental plaque formation. Biofilm inhibition these substances would be interesting to such an extent that there would generate an imbalance in the bacterial flora, thus keeping bacteria that act in a positive manner in the oral cavity. Thus, clinical studies are necessary to demonstrate the efficacy of these substances to prevent or even caries treatment.Cáries dentárias resultam de um desequilíbrio metabólico do biofilme dental, formado por bactérias, principalmente estreptococos e lactobacilos. Uma das formas de prevenir o processo carioso seria inibir a formação deste biofilme cariogênico. Este trabalho, portanto, objetiva verificar a inibição da formação de biofilme dentário formado por Streptococcus mutans (S. mutans) através da ação de quatro substâncias (epigalocatequina, clorexidina, xilitol e resveratrol), e verificar o provável mecanismo de ação a partir da expressão gênica das enzimas glicosiltransferase (GTF) e frutosiltransferase (FTF). O ensaio de reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizado para quantificar a expressão dos genes. Foram realizados ainda, ensaios de viabilidade celular e para verificação de formação de biofilme após tratamento com as substâncias testes para determinar concentrações em que houvesse inibição da formação de biofilme em condições de viabilidade celular. As concentrações de xilitol, resveratrol e clorexidina que se mostraram eficazes foram 100 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,001 mg/mL, respectivamente, ou seja, concentrações nas quais houve inibição da formação de biofilme sem modificação da viabilidade bacteriana. A epigalocatequina não apresentou uma concentração que proporcionasse inibição de biofilme sem a consequente morte bacteriana. Os tratamentos foram realizados com o xilitol, o resveratrol e a clorexidina, e após realização de RT-qPCR (reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real de transcrição reversa) foram obtidos os resultados referentes à expressão dos genes ftf e gtfb. Houve uma diminuição significativa (72,8%) na expressão gênica do ftf após o tratamento com xilitol. O resveratrol não interferiu na expressão deste gene e a clorexidina provocou redução da expressão do gene de controle (housekeeping gene), inviabilizando a avaliação da expressão do ftf na concentração avaliada. Não houve modificação significativa na expressão de gtfb após o tratamento com o resveratrol e a clorexidina nas concentrações definidas. O xilitol reduziu a expressão do housekeeping gene 16S rRNA, indicando morte celular na concentração testada. Os resultados nos levaram a concluir que as três substâncias - resveratrol, xilitol e clorexidina - atuam como potenciais agentes inibidores de biofilme dentário formado por S. mutans. Verificou-se, entretanto, que o xilitol inibe a expressão do gene ftf, indicando que o provável mecanismo de ação de tal inibição da formação do biofilme foi através da redução da expressão deste gene do S. mutans. A clorexidina já possui reconhecida ação bactericida, entretanto neste trabalho verificamos uma concentração desta substância em que houve inibição de biofilme sem a consequente morte celular. Diante dos achados podemos propor outras formas de aplicação do xilitol e da clorexidina, em odontologia, e também a utilização do resveratrol como um agente inibidor do processo carioso, já que o mesmo é capaz de inibir a formação de biofilme dentário. A inibição do biofilme por estas substâncias seria interessante de modo que não geraríamos um desequilíbrio na flora bacteriana, mantendo, portanto, bactérias que atuam de forma positiva na cavidade bucal. Desta forma, outros estudos laboratoriais e clínicos são necessários 16 para demonstrar a eficácia de tais substâncias para prevenção ou até mesmo tratamento de cáries dentárias.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio