Establishment and validation of a complex biofilm model in a multifunctional oral cavity simulator

Biofilm is directly related to dental caries etiology. Methodologies that allow investigating interactions between dental tissues and cariogenic biofilms are essential to pre-clinical research advancement. This study aimed to i) systematically review the literature on dental caries biofilm models and avaluate methodological parameters, bias risk, reproductibilitty and dose-response to anticariogenic or antimicrobial potential ii) develop and establish a complex biofilm model in a multifunctional oral cavity simulator (MOCS). Pubmed, Isi Web of Science and Scopus were searched to potential complete papers from 1990 to 2015. 381 papers were selected to systematic review and 59 papers were included in the sistematic review. It was concluded that despite bias risk found, several in vitro biofilm models are available for caries-related research. However most of complex and simplified models lacked of validation experiments such as dose-response trials and reproducibility for each established and proposed protocol. For the in vitro study, biofilms were formed on enamel bovine discs and human saliva was used as inoculum. Three independent experiments were carried out and biofilms were growth up to 21 days. Experiments 1 and 2 were related to the biofilm model establishment [experimental protocols (EP)] and the third evaluated dose-response to chlorehidine (CHX) and the model reprodutibilitty. EP1 used 10% sucrose in an intermittent pulse (1.2 mL/min, 5 min, 5 x/day) and continuous flow of artificial saliva (DMM, 0.04 mL/min). The biofilms were growth up to 14 days. EP2 used 5% sucrose (0.25 mL/min, 6 min, 3x/day) and DMM in continuos flow (0.06 mL/min) and the biofilm were formed up to 21 days. In the experimental times (4, 7, 14 or 21 days) microbiological and tooth samples were collected (n=10) and the outcomes were evaluated as percentage of superficial hardness change (%SHC), integrated hardness loss and colony forming units (CFU) counts. For the third experiment, the EP2 was used and biofilms were grown up to 7 days in association with CHX 0.012%, 0.03%, 0.06%, 0.12%, or saline solution as control. The treatment was applied twice a day. The outcomes were %SHC and CFU counts. Control data were compared to EP2 data (7 days) to evaluate the reprodutibillity of the model. Both EP1 and 2 showed that enamel demineralization and cariogenic microorganisms increase at 7 and 14 days compared to the initial experimental time (p<0.05). The model showed dose-respose to CHX regarding the mineral loss, total microorganisms and mutans streptococci counts. Also, a positive and significant correlation between hardness loss and microbiological values was observed. The proposed model demonstrated ability for cariogenic biofilm development, enamel demineralization and dose-response to CHX. Therefore, the MOCS seems to be a useful laboratory device to pre-clinical research related to dental caries.Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPqO biofilme está diretamente relacionado a etiologia da doença cárie. Metodologias que permitem investigar as interações presentes no conjunto formado pelo tecido dental e biofilme cariogênico são essenciais para o avanço em pesquisa pré-clínica. O objetivo desse trabalho foi i) realizar uma revisão sistemática sobre modelos de biofilme para cárie dental avaliando seus aspectos metodológicos, risco de viés, reprodutibilidade e e validação dose-resposta à anticariogênicos ou antimicrobianos; ii) desenvolver um modelo complexo de biofilme de microcosmos, em um simulador multifuncional de cavidade oral (MOCS). Pubmed, Isi Web of Science e Scopus foram consultadas para inclusão de artigos em inglês de 1990 até 2015. Foram selecionados 381 artigos e 59 artigos foram incluídos para a revisão. Conclui-se que diversos são os modelos de biofilme disponíveis para pesquisa relacionada a cárie dentária, no entanto, a maioria deles carecem de experimentos de validação como dose-resposta e reprodutibilidade para cada protocolo proposto. Para o estudo in vitro, os biofilmes foram formados sobre discos de esmalte, tendo como inóculo saliva humana. Realizou-se 3 experimentos independentes em que os biofilmes foram crescidos por até 21 dias. O 1º e o 2º experimento relacionaram-se ao desenvolvimento do modelo [adequação do protocolos experimentais (PE) 1 e 2] e o 3º para validação dose-resposta à clorexidina (CLX) e avaliação da reprodutibilidade do modelo. Para PE1 utilizou-se regime intermitente de 10% sacarose (1,2 mL/min, 5 min, 5x/dia) em associação a fluxo contínuo de saliva artificial (DMM, 0,04 mL/min), e os biofilmes foram crescidos por até 14 dias. Para o PE2 utilizou-se DMM em fluxo contínuo (0,06 mL/min) e 5% sacarose (0,25 mL/min, 6 min, 3X/dia) e houve crescimento por até 21 dias. Nos tempos experimentais de 4, 7, 14 ou 21 dias, amostras microbiológicas e minerais foram coletadas (n=10) e as variáveis de resposta estudadas foram: porcentagem de perda de dureza superficial, perda de dureza integrada e contagem de unidades formadoras de colônias microbianas (UFC). Para o experimento 3, utilizou-se o PE2 e os biofilmes foram crescidos por 7 dias em associação a aplicação de 5ml de Clorexidina em diferentes concentrações: 0,012%, 0,03%, 0,06%, 0,12% (n=10) e solução salina como controle (2x/dia a cada 12 h, a partir de 24 h do inóculo). Para esse experimento as variáveis de resposta foram obtidas por porcentagem de perda mineral de superfície e por composição microbiológica do biofilme. Dados do controle foram comparados aos dados do PE2 para avaliação da reprodutibilidade. Ambos PE 1 e 2 desencadearam perda mineral em esmalte e aumento dos micro-organismos acidúricos e lactobacilos em 7 dias de experimento (p < 0,05). Existiu dose-resposta à perda mineral e a microorganismos totais e mutans, assim como correlação positiva e significativa entre os valores minerais e microbiológicos. Por permitir o crescimento de um biofilme cariogênico e por desencadear desmineralização do esmalte e dose-resposta a CLX, a MOCS parece ser um recurso laboratorial válido para pesquisas pré-clínicas relacionadas a cárie dentária