Etablierung eines dreidimensionalen Infektionsmodells für Kuhpockenviren in humaner Haut und Charakterisierung der Infektion

Heutzutage stehen dreidimensionale Zellkulturmodelle für verschiedenste Anwendungen und Organe, z. B. die Haut, zur Verfügung. Für die Untersuchung viraler Infektionen bietet die Nutzung von 3D-Modellen eine wichtige physiologische Alternative, da die Organoide die Lücke zwischen Studien in klassischer 2D-Zellkultur und im Tiermodell schließen können. Im Rahmen dieser Studie werden die zoonotisch auftretenden Kuhpockenviren, als Vertreter der weitverbreiteten Pockenviren, untersucht. Diese replizieren in der Haut von Patienten und lösen dabei Läsionen aus. Zum Aufbau des Modells wurde zunächst die Kultivierung differenzierter Hautäquivalente aus primären humanen Keratinozyten und Fibroblasten etabliert. Die Hautäquivalente wurden nach dem Aufbau zur Differenzierung bis zu drei Wochen im Airlift-Verfahren kultiviert. Dabei wurden die Proliferation, Apoptose und Zell-Zell-Interaktionen charakterisiert und eine in vivo-ähnliche Morphologie und Differenzierung nachgewiesen. Das etablierte 3D-Modell wurde zu einem Infektionsmodell für Kuhpockenviren ausgebaut und zur Untersuchung der viralen Replikation, Virus-Wirts-Interaktionen und zur Testung potenzieller Inhibitoren eingesetzt. Für die Infektion wurden die Äquivalente mit hohen infektiösen Dosen überschichtet und die gebildete Hornschicht mittels Impfnadel verletzt. Die Virusreplikation konnte vor allem in der Epidermis des Äquivalentes und dabei die Primärinfektion hauptsächlich im basalen Bereich nachgewiesen werden. Im Vergleich zur Infektion in 2D-Kulturen verlief die Replikation langsamer und führte zu geringeren maximalen Virustitern, weil in stark infizierten Äquivalenten noch uninfizierte Bereiche zu finden waren. Darüber hinaus war die Oberflächenstruktur der Virionen in 3D-Kultur gegenüber 2D-Kultur spezifisch modifiziert. Eine Transkriptomanalyse mittels RNA-Sequenzierung lieferte wertvolle, qualitativ hochwertige Daten der Genregulation für kuhpockenvirale Infektionen in 3D-Geweben. So waren insbesondere die Differenzierung, Wundheilung und cytoskelettale Proteine während der Infektion reguliert. Die Regulation konnte für ausgewählte Gene mittels qPCR, Western Blot und immunhistochemischen Analysen verifiziert werden. Dabei konnte insbesondere die Bedeutung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins β-3 Tubulin während der Infektion im 3D-Modell belegt werden. Anhand von Dosis-Wirkungs-Kurven konnte die Nutzbarkeit des Modelles für Infektionsstudien dargelegt werden. Dabei zeigte die Infektion im 3D-Modell im Vergleich zum 2D-Modell eine höhere Sensitivität gegenüber dem verwendeten Hemmstoff Gefitinib, welcher sich potenziell auch für eine lokale Anwendung an Patienten im Rahmen eines Off-Label-Use eignen könnte. Das etablierte Infektionsmodell ist so auf verschiedenen Gebieten der Forschung an Kuhpockenviren eine wertvolle, physiologische Ergänzung zu den bestehenden Modellen basierend auf 2D-Zellkultur und Tierversuchen. Das Hautmodell kann in Zukunft auch für andere Viren ein wertvolles Werkzeug zum besseren Verständnis der Pathogenese und zur Entwicklung antiviraler Therapien sein