Deoxynivalenol에 의한 돼지 장상피세포 손상으로부터 이눌린의 장벽보호 기능

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :농업생명과학대학 농생명공학부,2019. 8. 윤철희.유산균의 먹이(prebiotics)로 알려진 이눌린은 난소화성 다당류로 장내 균총을 변화시키고 이들로부터 생산된 대사물질인 단쇄지방산은 장내 항상성을 유도하는 것으로 알려진다. 대부분의 연구에서 돼지에게 이눌린을 사료첨가제 형태로 급이함으로써 그 효과를 규명하였지만, 이눌린이 장상피세포에서 미치는 세포 및 분자적 기전은 잘 알려지지 않고 있어 이에 대한 연구가 필요한 실정이다. 본 연구는 돼지 장상피세포에서 이눌린이 장벽강화기능을 가지며 곰팡이 독소 유래의 Deoxynivalenol (DON)에 의한 손상으로부터 장벽보호기능이 있음을 보여준다. 본 연구에서 사용한 이눌린의 24시간 처리는 세포 사멸과 세포의 분열에는 영향을 끼치지 않으면서 세포내 장벽강화를 유도했다. 이눌린은 tight junction (TJ) 단백질인 ZO-1, OCLN, CLN3의 단백질 발현을 증가시켜 장벽의 투과성을 줄였음이 확인되었으므로, 돼지 장상피세포 (porcine intestinal epithelial cell-line, IPEC-J2) 에서 어떠한 기전에 의해 TJ 단백질의 발현이 증가하는지 확인하기 위해 관련 신호전달 물질을 관찰했다. 그 결과, 이눌린은 TJ 단백질을 증진시키는 신호전달 물질, Akt의 활성을 유도하였고, 이눌린을 통한 Akt의 활성을 억제하였을 경우, TJ 단백질 발현이 억제된다는 것을 관찰함에 따라 이는 Akt의 활성 유도에 의한 결과임을 확인할 수 있었다. 또한, 이눌린이 DON에 의한 장벽손상에 보호기능이 있는지 알아보기 위해 이눌린을 전 처리하였을 때 이는 DON으로 인해 증가되는 장관벽의 투과성을 억제하였고 세포사멸을 막으며, TJ의 붕괴를 억제할 뿐 아니라 염증성 사이토카인인 IL-8의 발현증가를 감소시킴을 확인하였다. 종합적으로, 본 연구는 DON에 의해 손상된 돼지 장상피세포에서 이눌린이 장벽보호가 Akt 기전을 통해 장벽보호기능을 향상시킨다는 것과 염증성 사이토카인을 줄일 수 있는 예방책으로서 기능이 있음을 보여주었으며, 효과적인 장벽보호제로서 이눌린의 이용 가능성을 제기한다.Inulin, when passing through the stomach and duodenum undigested, is known as highly nourishing to the colonic bacterial flora that convert inulin into short-chain fatty acids. Although the effects of inulin mostly as prebiotics in pigs have long been investigated, its action mechanism on porcine intestinal epithelial cells is not well understood. In the present study, protective role of inulin was examined on porcine intestinal epithelial cells (IPEC-J2) with/without damage induced by deoxynivalenol (DON). The results showed that inulin enhanced barrier function by inducing the increase of ZO-1, occludin, and claudin-3 in both mRNA and protein levels. Furthermore, inulin activated Akt which induce the expression of tight junction proteins. Pre-incubation of IPEC-J2 with inulin attenuated DON-induced decline of para-cellular and trans-cellular permeability and disruption of tight junction proteins. Moreover, inulin pretreatment inhibited DON-induced IL-8 expression suggesting that inulin may overwhelm the DON-induced inflammation. Collectively, the present study suggests that inulin directly strengthens the intestinal barrier function by increasing the tight junction proteins via Akt-dependent manner and decreasing the pro-inflammatory condition in damaged porcine epithelial cells.I. Review of Literature 1 1. Inulin 1 1.1 Potential role of prebiotics 1 1.2 Beneficial effects of inulin in pigs 2 1.3 Inulin-induced cellular activity 3 2. Deoxynivalenol 5 2.1 Definition and characteristics 5 2.2 Mechanism of disruption on intestinal barrier 7 2.3 Toxic effects in pigs 9 3. Tight junction proteins 10 3.1 Characterization of intestinal tight junction proteins 10 3.2 Zonula occluden family 11 3.3 Occludin family 11 3.4 Claudin family 12 4. Akt signaling and barrier protection 13 4.1 Akt signaling on the intestinal epithelial cells 13 4.2 Barrier protective effect of Akt 14 II. Introduction 15 III. Materials and Methods 18 1) IPEC-J2 culture 18 2) Inulin and DON treatment 18 3) Transepithelial electrical resistance assay 19 4) Real-time qRT-PCR 19 5) Western blot 21 6) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay 22 7) Enzyme-linked immunosorbent assay 23 8) Statistical analysis 24 IV. Results 25 1) Inulin enhances barrier function in IPEC-J2 cells 25 2) Inulin increases tight junction proteins in IPEC-J2 cells 27 3) Inulin activates Akt signaling to increase the expression of tight junction proteins in IPEC-J2 cells 29 4) Inulin prevents DON-induced barrier disruption in IPEC-J2 cells 33 5) Inulin alleviates DON-induced expression of IL-8 in IPEC-J2 cells 36 V. Discussion 38 VI. Literature Cited 42 VII. Summary in Korean 55Maste