대장염 모델 Ido1-/- 마우스에서의 장내 미생물체 분석

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 식품영양학과, 2014. 8. 신동미.차세대 염기서열 분석 기법이 발달함에 따라 인간과 공생하는 미생물에 관한 연구가 활발히 연구되고 있다. 특히 다른 기관에 비해 장내에는 매우 다양한 미생물들이 존재하고 있으며, 숙주의 면역체계와 긴밀한 상호관계를 맺고 있음이 알려져 있다. 선행연구 결과, Ido1 (indoleamine 2,3-dioxygenase 1트립토판 대사의 속도조절 효소)은 미생물 노출 정도의 차이에 따라 발현이 변화한 유전자 중 하나임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 트립토판 대사를 매개로 한 장내 미생물과 숙주의 염증반응과의 연관성을 밝히고자, Ido1-/-마우스와 Ido1+/+마우스를 사용하여 급성 대장염을 유도한 후, 파이로시퀀싱을 이용하여 장내 미생물체 분석을 실시하였다. 마우스는dextran sodium sulfate (DSS)를 녹인 음용수를 7일간 마우스에게 공급하여 급성 대장염을 유도하였다. 2% DSS를 공급한 두 유전자형의 마우스에서 모두 대장염이 유도됐으나 Ido1+/+ 마우스에서 더 심각한 염증이 유도됨을 관찰했다. 특히 DSS가 직접 영향을 끼치는 대장 조직에서 길이의 감소와 조직학적인 염증이 Ido1-/- 마우스에 비해 Ido1+/+ 마우스에서 유의적으로 더 높게 나타났다. 이어서 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 두 유전자형 마우스의 장내 미생물 군집의 차이를 분석하였고, 여덟 가지의 문(phylum)의 상이한 분포를 확인하였다. 흥미롭게도 Bacteroidetes 문(phylum)과 Firmicutes 문(phylum)의 비율이 두 군간에 유의적인 차이를 보였다. 또한Ido1-/- 마우스는 Bacteroides, Parabacteroides, Barnesiella, Prevotella 속(genus)이 유의적으로 높은 비율을 차지했다. 이 네 가지 박테리아 중 세 가지는 트립토판을 이용하여 인돌로 대사하는 것으로 알려져 있다. 특히 염증 정도가 높았던 Ido1+/+ 마우스에서 특이적으로 뮤신을 사용하는 Mucispirillum 과 병원성인 Escherichia/Shigella 속(genus)이 관찰됐다. 결론적으로 본 연구에서는 트립토판 분해효소 Ido1은 장내 박테리아 조성을 변화시킴으로써 장내 염증 반응 유도에 관여함을 제시하였다. 또한 숙주와 장 속에 공존하는 미생물체는 서로 영양소 대사 네트워크를 공유함으로써 서로 커뮤니케이션을 할 수 있다는 하나의 예를 제시하는 것으로 사료된다.Intestinal commensal bacteria get growing attention due to their beneficial roles in the host immune system. We proposed to test the hypothesis that tryptophan metabolism mediates the interaction between intestinal commensal bacteria and host inflammatory responses, using Ido1 (indoleamine 2,3-dioxygenase 1a rate-limiting enzyme in tryptophan metabolism) knock-out (Ido1-/-) mice and wild-type (Ido1+/+) mice. Mouse inflammatory bowel disease (IBD) model was induced by dextran sodium sulfate (DSS) treatment. Both Ido1-/- and Ido1+/+ mice developed colitis by 2% DSS treatmenthowever, Ido1+/+ mice developed much more severe colonic inflammation compared with Ido1-/- mice. Especially, colon lengths were shortened and histological scores were higher in Ido1+/+ mice than Ido1-/- mice. Metagenomic analysis was performed to identify any changes in colonic microbiome profiles between two different genotypes. 16S ribosomal RNA (16S rRNA) pyrosequencing analysis revealed that distinct distribution of eight phyla were observed between Ido1-/- and Ido1+/+ mice. Interestingly, ratio of Bacteroidetes to Firmicutes was significantly different in those two groups of mice. Ido1-/- mice turned out to have more Bacteroides, Parabacteroides, Barnesiella, Prevotella. Three out of these four bacteria are known to use tryptophan to produce indole. In Ido1+/+ mice, Mucispirillum, which utilize mucin and Escherichia/Shigella, which well known as pathogenic bacteria, was particularly high. Overall, these results suggest that Ido1 plays roles in development of mouse inflammatory bowel disease (IBD) through alteration of intestinal commensal bacteria profiles. Our findings provide one of the evidences that host system intestinal microbiota may communicate by sharing nutrient metabolism networks.I. Introduction 1 II. Materials and Methods 6 1. Animal 6 2. Induction of acute colitis with DSS 6 3. Evaluation of development colitis 9 4. Histology analysis 9 5. DNA extraction from large intestinal contents 12 6. Amplification of 16S rRNA gene and 454-pyrosequencing 12 7. Pyrosequencing data analysis 15 8. Statistical Analysis 15 III. Results 16 1. Different disease severity between Ido1+/+ and Ido1-/- mice 16 2. Pyrosequencing of 16S rRNA genes for microbial community analysis 24 3. Ratios of Bacteroidetes to Firmicutes 29 4. Commensal bacteria, depending on the absence of hosts tryptophan metabolism 34 5. Commensal bacteria, depending on the severity of the disease 38 IV. Discussion 43 V. References 49 국문초록 55Maste