Identification of postzygotic mutations associated with developmental anomalies including cutaneous mosaicism

Les anomalies du développement en mosaïque étaient demeurées difficiles à étudier sur le plan génétique, du fait de l’absence de techniques suffisamment sensibles pour détecter leur cause moléculaire. L’avènement du séquençage de nouvelle génération (NGS) a révolutionné l’identification de gènes responsables de ces affections en mosaïque impliquant la peau par l’analyse directe des tissus atteints. Grâce à deux projets ambitieux (PHRC national et ANR), nous avons pu recruter la plus large cohorte mondiale de patients porteurs d’un mosaïcisme que reflète le type d’atteinte cutanée (épidermique, vasculaire, pigmentaire…) et extracutanée (hypertrophie segmentaire). A partir d’une caractérisation clinique experte, les patients ont été orientés vers un NGS en profondeur ciblé sur un gène candidat sur tissu atteint lorsque leur présentation orientait vers un gène connu. Lorsque cette première analyse était négative, ou en l’absence d’orientation clinique, un séquençage d’exome complet en trio ou en paire a été réalisé, suivi d’une analyse bioinformatique spécifique pour la recherche de mutations en mosaïques. La confirmation secondaire par NGS ciblé en profondeur des variations candidates a été réalisée chez d’autres patients de phénotype analogue. La première approche a été principalement représentée par le séquençage de PIK3CA dans la plus grande cohorte à ce jour de patients présentant un spectre hypertrophique évocateur, avec ou sans atteinte cérébrale (210 patients). Elle a permis d’établir des recommandations pour le diagnostic moléculaire du PROS (spectre hypertrophique lié à PIK3CA). Nous avons démontré que l’analyse du tissu frais atteint est nécessaire pour identifier la mutation avec une rentabilité satisfaisante, établissant ainsi l’intérêt du NGS en profondeur tout en étendant l’hétérogénéité allélique de PIK3CA (Article 1). La deuxième approche, à partir du séquençage de l’exome en profondeur de plusieurs patients, a permis l’implication de trois nouveaux gènes responsables d’anomalies du développement avec atteinte cutanée en mosaique, et d’élargir le spectre phénotypique de quatre autres gènes. Parmi eux, nous avons identifié une mutation post-zygotique de BRAF (c.1803A>T ; p.Lys601Asn) dans une phacomatose pigmentokératosique, associée à un woolly hair naevus, une dysplasie focale corticale avec déficience intellectuelle et épilepsie, et un cavernome cérébral, négative pour HRAS et KRAS sur le nævus épidermique. Cette observation étend le spectre phénotypique des mutations post-zygotiques de BRAF, non syndromique (syringocystadénome papillifère isolé) ou syndromique neurologique (tumeurs cérébrales et dysplasie focale corticale) très différent du spectre des mutations constitutionnelles de BRAF (Article 2). Dans deux cas de nævus sébacé papillomateux et pédonculé chez des fœtus, négatifs pour les gènes HRAS et KRAS, nous avons identifié une mutation post-zygotique de FGFR2 (c.1144T>C ; p.Cys382Arg), étendant ainsi le spectre clinique et moléculaire des nævus épidermiques (Article 3). Enfin, une mutation activatrice du gène MTOR a été identifiée chez une patiente avec hypomélanose d’Ito, hémihypertrophie et atteinte cérébrale. D’autres mutations de MTOR ont été ensuite retrouvées chez quatre patients avec phénotype analogue dans notre cohorte. Ces résultats confirment les résultats obtenus par d’autres équipes dans l’hypertrophie cérébrale, en étendant le phénotype à l’atteinte cutanée pigmentaire, vraisemblablement du fait de la répartition des cellules mutées dans l’organisme (Article 4). Un traitement par inhibiteur de mTOR, a été tenté chez la première patiente, sans succès sur son épilepsie rebelle. La poursuite du travail à partir de cette cohorte exceptionnelle permettra de poursuivre l’identification des bases moléculaires de ces atteintes dermatologiques rares, et de répondre aux nombreuses questions d’ordre clinique, de conseil génétique et thérapeutiques posées par les famillesThe molecular basis of mosaic developmental anomalies has been intractable due to the lack of sensitive technique�� The advent of next generation sequencing (NGS) has revolutionized the identification of genes responsible for these mosaic conditions involving the skin by direct analysis of affected tissue. Thanks to two ambitious projects (national PHRC and ANR), we were able to recruit the largest cohort of patients with mosaicism that reflects the type of skin anomalies (epidermal, vascular, pigmentary, etc.) and extracutaneous anomalies (segmental hypertrophy). Based on an expert clinical characterization, in-depth targeted NGS was used on affected tissue when the clinical presentation was evocative of a known gene. When this initial analysis was negative, or in the absence of a clinical orientation, trio or pair exome sequencing was performed, followed by specific bioinformatics analysis for the identification of postzygotic mutations. The confirmation of candidate variations was performed by targeted NGS in other patients with a similar phenotype. The first approach was mainly represented by the sequencing of PIK3CA in the largest cohort to date of patients with an evocative overgrowth spectrum, with or without brain anomalies (210 patients), with the establishment of recommendations for the molecular diagnosis of PROS (PIK3CA related overgrowth spectrum). We have demonstrated that the analysis of the fresh affected tissue is mandatory to identify the mutation, thus establishing the interest of NGS while extending the allelic heterogeneity of PIK3CA (Article 1). The second approach, based on the the in-depth exome sequencing of several patients, has led to the identification of three genes responsible for developmental anomalies with cutaneous mosaic anomalies, and to widen the phenotypic spectrum of four other genes. Among them, we identified a post-zygotic mutation of BRAF ( c. l 803A> T; p.Lys601 Asn) in pigmentokeratotic phacomatosis, associated with woolly haïr nevus, focal cortical dysplasia with intellectual disability and epilepsy, and a cerebral cavemoma, negative for HRAS and KRAS on the epidermal nevus. This observation extends the phenotypic spectrum of post-zygotic BRAF mutations, non-syndromic (isolated papillary syringocystadenoma) or with neurological anomalies (brain tumors and cortical focal dysplasia), quite different from the spectrum of constitutional BRAF mutations (Article 2). In two fetuses with papillomatous and pedunculated sebaceous nevus, negativ for the HRAS and KRAS genes, we identified a post-zygotic mutation of FGFR2 (c. l 144T> C; p.Cys382Arg), thus extending the clinical and molecular spectrum of epidermal nevus (Article 3). Finally, an activating mutation of the MTOR gene was identified in a patient with Ito hypomelanosis, hemihypertrophy and brain anomalies. Other MTOR mutations were then found in four patients with a similar phenotype in our cohort. These results confirm the results obtained by other teams in cerebral hypertrophy, by extending the phenotype to pigmentary skin involvement, probably due to the distribution of mutated cells in the organism (Article 4). Treatment with an mTOR inhibitor was attempted in the first patient, but without success with her intractable epilepsy. Our exceptional cohort will allow to identify the molecular bases of these rare dermatological disorders, and to answer th many questions of families, of clinical nature or genetic and therapeutic advic