Physiological and molecular explorations of skin microvessel defects in classical-like Ehlers-Danlos syndrome

Le syndrome d’Ehlers-Danlos classical-like (SEDcl) de type I est une pathologie génétique rare, à transmission autosomale récessive, altérant les propriétés biomécaniques des tissus conjonctifs. Les trois symptômes majeurs sont une hyperlaxité cutanée, une hypermobilité généralisée des articulations et l’apparition d’hématomes sous-cutanés spontanés. D’autres manifestations cliniques sont retrouvées comme des déformations des mains et des pieds, une faiblesse musculaire légère à modérée, de l’hypertension artérielle, et parfois des anévrismes ou des hémorragies pré- ou post-partum, reflétant une certaine fragilité vasculaire. Les patients SEDcl de type I présentent des modifications génétiques sur les deux allèles du gène TNXB. Ce gène code une glycoprotéine de la matrice extracellulaire (MEC) nommée Ténascine-X (TNX) possédant deux rôles potentiels dans cette matrice. Le premier serait architectural, en permettant de maintenir l’espacement entre les fibrilles de collagènes par des interactions directes ou indirectes avec ces dernières. Le second serait dans la modulation du comportement cellulaire, par des interactions avec des récepteurs membranaires et des facteurs de croissance tels que le TGF-β et le VEGF, entrainant leur activation ou régulant leur biodisponibilité. Aucune étude mécanistique n’a encore été réalisée permettant de comprendre l’étiologie de la formation des ecchymoses spontanées, manifestation clinique pourtant retrouvée chez 86% des patients SEDcl de type I. L’objectif de ce projet de thèse était d’évaluer cette fragilité microvasculaire cutanée par une analyse physiologique et moléculaire approfondie à l’aide d’un modèle murin déficient en Tnx et mimant certaines manifestations cliniques du SEDcl de type I, comme l’hyperlaxité de la peau. Afin d’évaluer l’intégrité fonctionnelle des microvaisseaux de la peau, nous avons analysé les fonctions neurovasculaires cutanées en déterminant les capacités vasodilatatrices des microvaisseaux en réponse à différents stimuli. Nous avons montré que chez les souris déficientes en Tnx, la vasodilatation induite par une pression (PIV), était abolie. Toutes les autres fonctions neurovasculaires étant préservées chez ces souris, nous avons émis l’hypothèse que ce défaut de PIV était dû à une désorganisation et/ou une composition différente de la matrice autour des microvaisseaux, la rendant moins résistante face à la pression. Nous avons donc, dans un premier temps, mesuré par microscopie à force atomique (AFM), les propriétés biomécaniques du derme des souris. Pour ceci, nous avons élaboré un protocole original permettant de mesurer les propriétés nano-mécaniques du derme de la peau dorsale de souris par AFM. Cette approche nous a permis de montrer qu’à l’échelle supramoléculaire, le derme des souris déficientes en Tnx était plus déformable que celui des souris sauvages. En parallèle, nous avons étudié la composition moléculaire de ces peaux de souris par des analyses protéique et d’expression génique. Par des approches ciblées, nous n’avons pas mis en évidence de dérégulations des composants majeurs du derme. Ces résultats allant à l’encontre des données de la littérature, une analyse globale du Matrisome cutané est en cours d’étude au laboratoire. Enfin, lors de la réalisation de ces analyses, nous avons relevé que les souris hétérozygotes pour la Tnx présentaient également un phénotype, pouvant parfois être plus sévère que celui des souris homozygotes déficientes. Potentiellement, ces souris pourraient donc être un bon modèle pour le sous-type de SED hypermobile causé par des mutations à l’état hétérozygote dans le gène TNXB. En conclusion, ces travaux de recherche nous ont permis de décrypter plus en profondeur les caractéristiques du modèle murin déficient en Tnx, de mettre en évidence l’implication de la glycoprotéine dans les fonctions neurovasculaires cutanées et d’apporter plus d’éléments de réponse quant à son rôle au sein de la matrice extracellulaire.Type I classical-like Ehlers-Danlos syndrome (clEDS) is a rare autosomal recessive genetic disorder altering the biomechanical properties of connective tissues. The three major symptoms are skin hyperlaxity, generalized joint hypermobility and easy bruising, with the formation of spontaneous subcutaneous haematomas. Other clinical manifestations include deformities of hands and feet, mild to moderate muscle weakness, arterial hypertension, and sometimes aneurysms or pre- or post-partum haemorrhages, reflecting a global vascular fragility. Type I clEDS patients have genetic alterations in both alleles of the TNXB gene. This gene encodes an extracellular matrix (ECM) glycoprotein called Tenascin-X (TNX), which has two potential roles in this matrix. The first would be architectural, by maintaining the spacing between collagen fibrils, by direct or indirect interactions with them. The second would be the modulation of cell behaviour through interactions with growth factors such as TGF-β and VEGF, leading to their activation or the regulation of their bioavailability. No mechanistic study has been performed to understand the aetiology of spontaneous bruising, although this clinical manifestation has been found in 86% of type I clEDS patients. The objective of my thesis project was to evaluate this cutaneous microvascular fragility through an in-depth physiological and molecular analysis, using a mouse model deficient in Tnx and mimicking some clinical manifestations found in clEDS patients, such as skin hyperlaxity. In order to assess the functional integrity of skin microvessels, we analysed cutaneous neurovascular functions by determining the vasodilatory capacities of microvessels in response to different chemical or non-chemical stimuli. We showed that in Tnx-deficient mice, pressure-induced vasodilation (PIV) was abolished. This mechanism maintains skin homeostasis by preserving an optimal level of oxygenation within the skin. As all other neurovascular functions were preserved in these mice, we hypothesized that this PIV defect was due to a disorganisation and/or a different composition of the matrix around the microvessels, making it less resistant to pressure. We therefore measured the biomechanical properties of the mouse dermis by atomic force microscopy (AFM). For this, we have developed an original protocol to measure the nano-mechanical properties of the dermis of the dorsal skin of mice by AFM. This approach allowed us to show that at the supramolecular level, the dermis of Tnx-deficient mice was more deformable than the wild-type one. In parallel, we investigated the molecular composition of the skin of these mice by protein and gene expression analyses. By targeted approaches, we did not show any deregulation of the major components of the dermis. As these results are in contradiction with the literature, a global analysis of the cutaneous Matrisome is under study in the laboratory. Finally, by performing all these analyses, we found that Tnx heterozygous mice also had a phenotype, which could sometimes be more severe than that of the homozygous deficient mice. These mice could therefore potentially be a good model for the hypermobile subtype of EDS caused by heterozygous mutations in the TNXB gene. In conclusion, this research work has allowed us to further decipher the characteristics of the Tnx-deficient mouse model to highlight the involvement of this glycoprotein in cutaneous neurovascular functions and to provide more information on its role within the extracellular matrix