The investigation of the role of estrogen related receptor β and γ (ERRβ and ERRγ) in rodent Leydig cells functions

Estrogeny to hormony steroidowe, które w organizmie samca regulują wiele ważnych procesów, zarówno w układzie rozrodczym jak i tkankach pozadonadalnych. Jedną z możliwych i wciąż słabo poznanych dróg oddziaływania estrogenów w komórkach jest sygnalizacja z zaangażowaniem receptorów pokrewnych receptorom estrogenowym (ERRs, ang. estrogen related receptors). Celem niniejszej pracy było zbadanie znaczenia receptorów pokrewnych receptorom estrogenowym typu β i γ (ERRβ i ERRγ) w funkcjonowaniu komórek Leydiga gryzoni. Badania prowadzono w systemie in vitro z użyciem mysich nowotworowych komórek Leydiga linii MA-10, w których ekspresja receptorów ERRβ i ERRγ wyciszona została za pomocą specyficznego siRNA. Barwienie fluorescencyjne umożliwiło zbadanie ilości i rozmieszczenia kropli lipidowych w transfekowanych komórkach Leydiga. Z kolei techniki immunocytochemiczne pozwoliły na określenie lokalizacji i poziomu ekspresji markerów steroioidogenezy oraz receptorów steroidowych. W celu zbadania proliferacji i wzrostu komórek w hodowli po ich mechanicznym uszkodzeniu (ang. scratch assay) dokonano obserwacji przy użyciu mikroskopu z kontrastem fazowym. Natomiast technikę radioimmunologiczną (RIA) wykorzystano do określenia stężenia hormonów steroidowych produkowanych w komórkach linii MA-10. Wybarwienie komórek Czerwienią Nilu pozwoliło na stwierdzenie, że brak aktywności receptorów ERRβ i ERRγ doprowadził do zaburzenia wielkości, liczby i rozmieszczenia kropli lipidowych w komórkach Leydiga. Na podstawie barwienia immunofluorescencyjnego stwierdzono jedynie niewielkie zmiany poziomu ekspresji insulinopodobnego białka 3 (INSL3) oraz białka translokującego (TSPO) po wyciszeniu ekspresji receptorów ERRβ i ERRγ. Nie stwierdzono zmian w ekspresji kluczowego dla steroidogenezy enzymu, dehydrogenazy 3β-hydroksysteroidowej (3β-HSD). Dzięki analizie Western blot i ocenie densytometrycznej wykazano istotny spadek ekspresji receptorów estrogenowych typu α i β (ERα i ERβ) oraz receptora androgenowego (AR) w transfekowanych komórkach w porównaniu do kontroli. Po wyciszeniu receptora ERRβ i mechanicznym uszkodzeniu komórek MA-10 w hodowli stwierdzono zaburzenia migracji komórek i zdolności wzrostu w monowarstwie. W tym przypadku komórki Leydiga wykazywały tendencję do skupiania się w grupy w wyniku czego po obu stronach zadrapania obserwowano konglomeraty komórkowe różnej wielkości. Analiza radioimmunologiczna pozwoliła na stwierdzenie, że wyciszenie ekspresji receptorów ERRβ i ERRγ w mysich nowotworowych komórkach Leydiga spowodowało wzrost produkcji progesteronu. Zatem, wyciszenie ekspresji receptorów ERRβ i ERRγ wpływa na morfologię i fizjologię komórek Leydiga w hodowli. Niewielkie zmiany w ekspresji białkowych markerów w transfekowanych komórkach MA-10 świadczy o braku wpływu ERR na biosyntezę hormonów steroidowych. ERRβ, ale nie ERRγ, kontroluje migrację i wzrost komórek w monowarstwie. Receptory ERRβ i ERRγ zdają się nie być bezpośrednio zaangażowane w kontrolę proliferacji komórek Leydiga. Ważniejszą rolę w tym procesie odgrywa molekularne i hormonalne mikrośrodowisko, zarówno wewnątrz jak i w bezpośrednim sąsiedztwie komórek Leydiga. Uzyskane wyniki sugerują, że sygnalizacja estrogenowa z udziałem receptorów ERRβ i ERRγ może odgrywać istotną rolę w procesie nowotworzenia w komórkach Leydiga.Estrogens are a group of steroid hormones that regulate many important processes in male, both in the reproductive system and in the extragonadal tissues. One of the possible and still not fully characterize way of estrogens action is signaling via estrogen related receptors (ERRs). The aim of this study was to investigate the role of estrogen related receptor β and γ (ERRβ and ERRγ) in rodent Leydig cells functions. The study was carried out in vitro with the MA-10 mouse tumor Leydig cells, in which the expression of ERRβ and ERRγ was silenced via specific siRNA. The number and distribution of lipid droplets in transfected Leydig cells were analysed after fluorescent staining. The localization and expression levels of sterioidogenic markers and steroid receptors were examined by immunofluorescence and Western blotting. Cell proliferation and monolayer formation capacities after scratch assay were performed by inverted phase-contrast microscope. Additionally, hormon secretion in MA-10 cells was assessed by radioimmunologyassay (RIA). Nile Red staining revealed that a lack of ERRβ and ERRγ activity affected size, number and distriution of lipid droplets in Leydig cells. Immunofluorescent staning showed only subtle changes in the expression levels of insulin-like protein 3 (INSL3) and translocation protein (TSPO) in cells transfected with specific siRNAs for ERRβ or ERRγ. There were no changes in the expression of a key steroidogenesis enzyme, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD). Western blot followed by densitometry revealed significant decrease of estrogen receptor α and β (ERα and ERβ) and androgen receptor (AR) expression in transfected cells when compared to control. After the scratch in ERRβ knockdown Leydig cells changes in cell growth and monolayer formation were observed. In this case, cells often formed clumps on both sides of the scratched area. Finally, it was confirmed by radioimmunoassay that in both ERRβ and ERRγ knockdown mouse tumor Leydig cells a significant increase in progesterone levels was found. Taken together, lack of ERRβ i ERRγ affected Leydig cell morphology and physiology in culture. MA-10 cells with silenced ERRβ and γ activity showed small changes in the expression of functional marker proteins, indicating unaffected steroid secretory function. ERRβ, but not ERRγ, control Leydig cell migratoin and monolayer formation. Both receptors are not directly involved in cell proliferation. Hormonal and molecular microenvironment inside and outside the Leydig cells seems to be more important for this process. Results of this study suggest that estrogen signaling via estrogen related receptor β and γ may play an important role in Leydig cell tumor development