Study of 53BP1 foci formation dynamics after chromatin damage induced by visible light: dependence on wavelength and dose of light

Uszkodzenia DNA, w szczególności pęknięcia dwuniciowe, są wysoce niebezpieczne dla zachowania ciągłości genomu. Mechanizm odpowiedzi komórkowej na dwuniciowe pęknięcia DNA jest wciąż badany, wiadomo jednak, że niesie on ze sobą szereg potranslacyjnych modyfikacji histonów takich jak metylacja reszty lizyny 20 histonu H4 (H4K20me2), ubikwitynacje lizyny 15 histonu H2A (H2AK15ub) czy fosforylacje. Takie modyfikacje rozpoznawane są przez domeny czynnika naprawczego 53BP1: domena Tudor oddziałuje z H4K20me2 a UDR z H2AK15ub. 53BP1 bierze udział w wyborze drogi naprawczej dwuniciowego uszkodzenia DNA. Naprawa uszkodzeń DNA komórek, będących w fazie G1/G0, odbywa się głównie na drodze łączenia niehomologicznych zakończeń (NHEJ), promowana przez 53BP1, natomiast komórek będących w fazie S i G2 cyklu komórkowego – rekombinacji homologicznej (HR), związanej z antagonistą 53BP1, białkiem BRCA1. Białka naprawcze, w eksperymentach stosujących do wywołania uszkodzenia DNA promieniowanie jonizujące, UV bądź światło widzialne, tworzą wyraźne ogniska (foci) w miejscu uszkodzenia.Celem niniejszej pracy magisterskiej było zbadanie dynamiki powstawania ognisk białka fuzyjnego EGFP-53BP1 po wywołaniu lokalnego uszkodzenia chromatyny za pomocą światła widzialnego, w zależności od długości fali światła oraz od jego dawki.Doświadczenia przeprowadzano na komórkach żywych, po wprowadzeniu do nich wektora plazmidowego, w celu wywołania przejściowej ekspresji białka fuzyjnego EGFP-53BP1. Po ekspozycji chromatyny na światło widzialne (488 nm – 594 nm), techniką parkowania wiązki lasera, zaobserwowano powstawanie ogniska białka fuzyjnego w miejscu uszkodzenia. Nie zaobserwowano gromadzenia białka EGFP-53BP1, po ekspozycji na światło o długości fali 633 nm. Odnotowano, że maksymalne wartości powierzchni focus białka nie zależą od dawki światła lecz istnieje dawka minimalna wywołująca uszkodzenie. Zauważono również, że EGFP-53BP1 wykazuje co najmniej dwa typy tworzenia ogniska. Ognisko EGFP-53BP1 może nie zanikać do mitozy, a nawet trwać w komórkach potomnych. Pokazano również, że po wywołaniu uszkodzenia, za pomocą światła o długościach fali krótszych niż 561 nm, doszło do znacznego fotoblaknięcia fluorescencji EGFP, przez co fototoksyczność białka fluorescencyjnego mogła wywołać zaburzenia układu. Wobec tego postanowiono podjąć próbę skonstruowania nowego wektora plazmidowego niosącego gen mRFP-53BP1, za pomocą klasycznego klonowania molekularnego.DNA damages especially double-strand breaks are highly dangerous for maintenance genome integrity. Mechanism of double-strand DNA damage response is still being prospected, however, it is known that it promotes a number of histone post-tranlational modifications, such as dimethylation of Lys20 of histone 4 (H4k20me2), ubiquitilation of Lys15 of histone H2A (H2AK15ub) or phosphorylations. Such modifications are recognized by 53BP1 (repair factor) domains: Tudor interacts with H4K20me2 and UDR motif binds to H2AK15ub. 53BP1 takes part in choosing of repair pathway in response to DSBs of DNA. DNA damages repair for G1/G0 phase cells are mostly performed by nonhomologous end joining that 53BP1 promotes, by contrast, for S/G2 phase cells it is followed by homologous recombination that the 53BP1 antagonist – BRCA1 promotes. Repair proteins create noticeable foci in experiments that use ionising radiation, UV or visible light to induced DNA damages.The purpose of this master's thesis was to investigate of EGFP-53BP1 foci formation dynamics after local chromatin damage induced by visible light, in particular on wavelenght and dose of light dependence.Experiments were carried on living cells after imposition of plasmid vector to elicit transient expression of EGFP-53BP1 fusion protein. EGFP-53BP1 focus formation in site of damage was observed after chromatin exposure to visible light (488 nm – 594 nm) by laser beam park technique. Focus formation was not observed after usage of 633 nm light wavelenght. 53BP1 exhibits at least two types of foci formation. Maximum values of foci surfaces do not depend on dose of light but the minimal dose of light exist. EGFP-53BP1 focus can be continued untill mitosis and go on after cell division. Photobleaching effect appeared after induction of local chromatin damage by shorter than 561 nm wavelenghs. It could cause activation of fototoxicity of EGFP and could disturb studied system. Because of that side effect, the trial to get plasmid vector with mRFP-53BP1 protein was made