低分子量細菌素在Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum以類第三類分泌系統分泌至胞外之研究

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (P.c.c.)為腸道菌科的革蘭氏陰性菌，偏好寄生於植物，常造成十字花科植物根莖部腐爛之疾病，是導致許多植物軟腐病的植物病原細菌。當環境不利於細菌生存時，細菌會分泌一種胞外抗生蛋白 (細菌素)，能夠抑制或殺死與生產菌株有相近親緣關係的菌種。 第三類分泌系統(T3SS)中的可分為刺針型(T3aSS)和鞭毛型(T3bSS)，此兩種機制在結構及功能上是非常密切及相似的，在大部分的結構組成蛋白和功能具有同源性，從本實驗室先前的研究中，發現低分子量的細菌素Carocin，主要是經由第三類分泌系統(T3SS)中的鞭毛系統分泌至細胞外。刺針型(T3aSS)主要能使效應蛋白直接送入宿主細胞，效應蛋白會改變宿主的細胞功能或是細胞膜結構，達到侵入的作用或是共生目的。其鞭毛型(T3bSS)目的是將蛋白從胞內分泌至胞外及在液體中移動。 從本實驗室的研究中得知，在P.c.c.菌種內的Carocin表現相關機制裡，DGC與CRP等調控因子扮演了重要的角色，當調控因子被阻斷掉之後，分別在T3aSS及T3bSS的基因ysaT及flhA等基因均不再表現，進而造成低分子量細菌素無法被分泌至細胞外。此依結果顯示P.c.c.的低分子量細菌素有可能是透過T3aSS及T3bSS兩系統所整合的新形態的第三類分泌系統分泌至胞外。 本實驗成功的將flhA及ysaT基因subcloned至pET32a質體上，並在RT-PCR的實驗中證實了，重組過後的質體是能正常的做轉錄作用。為了讓重組質體能大量表現目標基因的蛋白，本實驗利用IPTG去做誘導表現。由於這兩個蛋白皆為膜蛋白，我們嘗試了許多界面活性劑及各種條件，最後我們得知FlhA蛋白利用1 % Triton X-100才能使之萃取出，YsaT蛋白則是利用1 M NaCl水溶液即可將此蛋白萃取出來。摘要 i Abstract ii 目次 iii 表目次 iv 圖目次 v 名詞縮寫表 vi 第一章 緒論 1 1.1 Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum與細菌性軟腐病 1 1.2 細菌素(Bacteriocin) 3 1.3 細菌之分泌系統 6 1.4 第三類分泌系統(Type III secretion system, T3SS) 7 1.5 膜蛋白(Membrane protein) 9 1.6 研究目的 11 第二章 材料與方法 12 2.1 實驗使用之菌株、質體及引子 12 2.2 細菌培養 14 2.3 質體DNA之分離 15 2.4 洋菜膠體(Agarose gel)配置與DNA電泳分析 17 2.5 勝任細胞與轉型作用 18 2.6 DNA片段回收與純化 21 2.7 選殖基因與質體構築 22 2.8 蛋白誘導表現 26 2.9 SDS-PAGE製備與蛋白質電泳分析 27 2.10 西方墨點法(Western blot) 29 2.11 RT-PCR 31 第三章 實驗結果 33 3.1 flhA基因重組載體構築 33 3.2 構築體的mRNA表現 34 3.3 融合蛋白誘導大量表現 35 第四章 討論 36 參考資料 5