Comparative histological analysis on testicular atrophy and early recrudescence of White Leghorn Chicken and White Roma Goose

For animals with seasonal reproduction, their gonads are well developed and producing gametes during breeding season; the gonads undergo atrophy and apoptosis while entering the non-breeding season. This change is regulated by the hypothalamic–pituitary–gonadal (HPG) axis such that seasonal breeders experience annual cycles of reproductive quiescence and renaissance. White Roman gooses are short-day breeder, they have reproductive activity in winter and gonad regress in summer. Wild chicken are long-day breeder, their reproductive periods are in summer and in winter the gonad undergo regression . White Leghorn chicken are well domesticated breeder with relatively pure genetic background and individual differences are smaller than other avian species. Therefore, White Leghorn chicken is an ideal animal model for investigating the genetic and molecular mechanisms of cellular changes of gonad regression and recrudescence. However White Leghorn chicken has no seasonal reproduction and will require further comparative analysis seasonal breeders to ensure proper application. In our experiments we use forced-molting to change Leghorn rooster gonad state, and testes were collected in different time point during forced-molting；while goose testicular tissues are harvested according to their nature annual cycle of reproduction. The testis size dropped 35% in chicken and dropped 86.5% in goose and testicular structures were analyzed with IHC，we found both of their somatic cells and germ cells were decreased during testicular regression and apoptotic cells were increased in rooster testes. When testes revived, both of their somatic cell and germ cell were increased and total proliferating cell in testes also expand. According these results, we concluded that artificial induced gonadal change and naturally gonadal change have similarly process.季節性生殖的動物因應光照周期、溫度、食物供應的變化而造成生殖腺活性 的改變。此變化乃經由下視丘-腦下垂體-生殖腺軸向的調控導致生殖腺歷經萎縮 和再生的季節性變化。白羅曼鵝為短日照繁殖動物，冬天繁殖而夏天生殖腺進入 休眠狀態，紅叢林雞為長日照繁殖動物，夏天繁殖而冬天生殖腺進入休眠狀態； 在品種上來亨雞的遺傳背景相對比較單純，個體差異相對較小，因此適合作為探 討生殖腺內部細胞變化的分子機制的模式動物，但是來亨雞經人類長期馴化使其 失去其季節性繁殖的特性，我們分析來亨雞睪丸以人工誘發生殖腺萎縮與再生並 和季節性生殖的公鵝生殖腺做比較，看是否可為季節性生殖研究的模式動物。 在本實驗中我們利用強迫換羽的方式，改變來亨公雞的生殖腺狀態，我們發 現來亨公雞可以利用強迫換羽的方式造成生殖腺的萎縮和再回復，白羅曼鵝則在 生殖期、生殖後期、非生殖期及生殖前期分別取樣本。而透過組織免疫染色的結 果，我們發現正常狀態下的公雞至禁食低點，公鵝從生殖期至非生殖期睪丸內部 的體細胞和生殖細胞皆有變少的現象，睪丸內增生中的細胞也變少，在公雞睪丸 內細胞的凋亡也有明顯變多。而公雞在回復過程中(禁食低點至恢復7 天)，公鵝 從非生殖期至生殖前期，我們發現體細胞和生殖細胞皆有變多，睪丸內增生細胞 有變多的現象，在公雞睪丸內細胞凋亡也減少了；然而公鵝睪丸內的細胞凋亡在 各時期間沒有明顯差異。因此人為誘發的生殖腺狀態改變和季節性生殖的改變， 其睪丸內細胞形態組成有是類似的變化。摘要 .................................................... I ABSTRACT ............................................ II 壹、前言 ................................................ 1 一、雄性脊椎動物生殖腺之發育 ..................................................................................................... 1 1.哺乳類 - 以小鼠為例 ............................................................................................................... 1 2.鳥類- 以雞為例 ........................................................................................................................ 2 二、脊椎動物的精子成熟過程 ......................................................................................................... 3 三、荷爾蒙對睪丸發育之調控 ......................................................................................................... 4 四、鳥類的季節性繁殖 ..................................................................................................................... 5 貳、研究動機與實驗設計 ................................... 7 一、目的 ............................................................................................................................................. 7 二、研究動機 ..................................................................................................................................... 7 三、實驗設計 ..................................................................................................................................... 8 參、實驗材料與方法 ...................................... 8 一、 實驗動物 ............................................................................................................................... 8 二、 家禽強迫換羽之流程 ........................................................................................................... 9 三、組織固定和石蠟包埋 ................................................................................................................. 9 四、HEMATOXYLIN 染色 .................................................................................................................. 10 五、免疫組織螢光染色 ................................................................................................................... 10 六、免疫組織化學染色(IMMUNOHISTOCHEMISTRY, IHC) ............................................................... 11 七、TUNEL 檢測 ............................................................................................................................. 11 八、量化細胞數目 ........................................................................................................................... 11 肆、實驗結果 ........................................... 13 一、公雞在強迫換羽過程中體形及睪丸之變化 ............................................................................ 13 二、公雞經過強迫換羽後睪丸內部細胞形態之比較 .................................................................... 13 1. 公雞睪丸內細胞凋亡的數目與形態之比較 .......................................................................... 13 2. 公雞睪丸內Sertoli cell 數目與形態之比較 ........................................................................ 14 3. 公雞睪丸內Leydig cell 數目與形態之比較 ........................................................................ 14 4. 公雞睪丸內增生中的細胞數目與形態之比較 ...................................................................... 14 iv 5.公雞睪丸內分化中精原母細胞(Differentiating spermatogonia)數目與形態之比較 ............. 15 6. 公雞睪丸內欲進入減數分裂的生殖細胞數目與形態之比較 .............................................. 15 三、公鵝在各生殖期間體型、睪丸大小及睪丸內部細胞形態之比較 ........................................ 15 1. 公鵝在各生殖期間體形及睪丸之變化 .................................................................................. 16 2. 公鵝睪丸內細胞凋亡的數目與形態之比較 .......................................................................... 16 3. 公鵝睪丸Sertoli cell 及Leydig cell 數目與形態之比較 ....................................................... 16 4. 公鵝睪丸內增生中的細胞數目與形態之比較 ...................................................................... 16 5. 公鵝睪丸內分化中精原母細胞(Differentiating spermatogonia) ........................................... 16 伍、討論 ............................................... 18 一、來亨公雞利用強迫換羽造成睪丸外形上的變化 .................................................................... 18 二、公雞經過強迫換羽後與公鵝睪丸內細胞組成之異同 ............................................................ 19 三、細胞標誌蛋白(CELL MARKER)選用上之困難 .............................................................................. 20 六、結論 ............................................... 22 柒、參考文獻 ........................................... 57 v 文獻圖目次 圖A 、精子生成過程與組織細胞構造。 ................................ 25 圖B、荷爾蒙對睪丸的調控。 ......................................... 26 圖C、光週期訊號在鳥類與哺乳類的傳導路徑。 ......................... 27 圖D、不同日照條件下 T4、T3 的轉換。 .............................. 28 圖E、家雞TSHR GENE 突變導致其失去對光照的反應。 ................. 29 vi 圖表目次 表1、本論文所使用的一級抗體(FIRST ANTIBODY ) .................... 23 表2、本論文所使用的二級抗體(SECOND ANTIBODY ) .................. 24 圖 1、公雞在強迫換羽期間睪丸大小會隨體重變化而改變 ................ 30 圖 2、公雞強迫換羽期間細精管直徑隨著睪丸萎縮而變小 ................ 31 圖3、公雞睪丸內細胞凋亡的情形 .................................... 32 圖4、公雞睪丸內SERTOLI CELL 的分布情形 .......................... 33 圖5、公雞強換羽期間睪丸內SERTOLI CELL 數量在禁食低點有減少的情形 34 圖6、公雞睪丸內LEYDIG CELL 的分布情形 ........................... 35 圖7 、公雞睪丸內LEYDIG CELL 的數量在在禁食低點開始有減少的情形 .. 36 圖 8、公雞睪丸內增生中的細胞在禁食低點有顯著減少 .................. 37 圖 9、公雞睪丸內增生中的SERTOLI CELL 的分布情形 .................. 38 圖10、在回復期間公雞睪丸內增生中的SERTOLI CELL 有增加的趨勢 ..... 39 圖 11、公雞睪丸內增生中的GERM CELL 的分布情形 ..................... 40 圖12、在禁食低點期間公雞睪丸內增生中的GERM CELL 明顯較少 ....... 41 圖14 、C-KIT POSITIVE 細胞在公雞睪丸內的分布情形 ................. 43 圖15、公雞睪丸內C-KIT POSITIVE 細胞數目變化 ..................... 44 圖16、SCP3 POSITIVE 的細胞在公雞睪丸內的分布 ..................... 45 圖 17、公鵝各生殖期體重及睪丸大小變化 ............................. 46 圖 18、公鵝各生殖期細精管直徑之變化 ............................... 47 圖 19、公鵝睪丸在各生殖週期中細胞凋亡的數目並無顯著變化 ........... 48 圖20、公鵝睪丸內SERTOLI CELL 的分布情形 ........................ 49 圖21、公鵝睪丸內SERTOLI CELL 的數量在生殖後期開始有減少的情形 ... 50 圖 22、公鵝睪丸內LEYDIG CELL 的分布情形 .......................... 51 圖23 、公雞睪丸內LEYDIG CELL 的數量在在禁食低點開始有減少的情形 . 52 圖24、公鵝睪丸內細胞增生在非生殖季時有顯著減少 .................... 53 圖25 、C-KIT POSITIVE 細胞在公鵝睪丸內的分布情形 ................. 54 vii 圖26 、公鵝睪丸內C-KIT POSITIVE 細胞的數量變化 ................... 55 圖27、公鵝睪丸內SCP3 POSITIVE 細胞數量變化 ...................... 5