Sobre l'optimització de la Microscòpia de Localització de Molècula Única mitjançant Deep Learning

The greatest advances in the biomedical field would not have been possible without microscopy. The higher the resolution of the image obtained, the more details one can know about the sample. In the last few decades, microscopy have progressed from differentiating objects at millimetres of distance to the nanoscale. The latter accuracy is achieved using the contemporary super resolution microscopy, including Single Molecule Localization Microscopy, examples of which are the fluorescence microscopy techniques PALM and STORM. This kind of imaging method is done by stochastically activating and deactivating a set of fluorescent molecules distributed in a sample, taking a picture of it with a CCD camera in every switch, and then processing all the frames to obtain a final image. However, nowadays precision is of tens of nanometres, which suggests that there is still room for improvement. Furthermore, the state?of?the?art super resolution techniques still exhibit certain drawbacks such as overlapping between emitters PSFs and the difficulty to make molecular tracking especially due to photobleaching. Therefore, some techniques have recently been developed to improve super resolution microscopy, such as MINFLUX and DeepSTORM. MINFLUX aims to minimize the number of emitted photons required for the localization of molecules with the main objective of being able to do molecular tracking, while DeepSTORM focuses on eliminating the overlapping of PSFs using a Deep Learning algorithm to create a phase mask that generates a suitable PSF for this purpose. In this project both techniques are to be combined expecting to obtain highly accurate estimations of the emitters? two?dimensional positions with resolutions of units of nanometres, while avoiding overlapping of PSFs in highly dense samples and minimizing the number of photons emitted per fluorophore.Los mayores avances en el campo biomédico no habrían sido posibles sin la microscopía. Cuanto más alta es la resolución de la imagen obtenida, más detalles se pueden conocer de la muestra. En las últimas décadas, la microscopía ha progresado desde la diferenciación de objetos a milímetros de distancia hasta la nanoescala. Esta última precisión se logra utilizando la microscopía contemporánea de súper resolución, incluyendo la Microscopía de Localización de Moléculas Únicas, ejemplos de las cuales son las técnicas de microscopía de fluorescencia PALM y STORM. Este tipo de método de obtención de imágenes se realiza activando y desactivando estocásticamente un conjunto de moléculas fluorescentes distribuidas en una muestra, tomando una fotografía de la misma con una cámara CCD en cada cambio, y luego procesando todos los fotogramas para obtener una imagen final. Sin embargo, hoy en día la precisión es de decenas de nanómetros, lo que sugiere que todavía hay margen de mejora. Además, las técnicas de súper resolución de última generación todavía presentan ciertos inconvenientes como la superposición entre las PSF de los emisores y la dificultad de hacer seguimiento de la trayectoria molecular, especialmente debido al efecto conocido como photobleaching. Es por eso que recientemente se han desarrollado algunas técnicas para mejorar la microscopía de súper resolución, como MINFLUX y DeepSTORM. MINFLUX tiene por objetivo reducir al mínimo el número de fotones emitidos necesarios para la localización de las moléculas con el objetivo principal de poder hacer el seguimiento molecular, mientras que DeepSTORM se centra en eliminar la superposición de las PSF utilizando un algoritmo de Deep Learning para crear una máscara de fase (phase mask) que genere una PSF adecuada para este fin. En este proyecto se combinarán ambas técnicas esperando obtener estimaciones muy precisas de las posiciones bidimensionales de los emisores con resoluciones de unidades de nanómetros, evitando al mismo tiempo la superposición de PSF en muestras muy densas y reduciendo al mínimo el número de fotones emitidos por cada fluoróforo.Els majors avenços en el camp biomèdic no haurien estat possibles sense la microscòpia. Com més alta és la resolució de la imatge obtinguda, més detalls es poden conèixer de la mostra. En les últimes dècades, la microscòpia ha progressat des de la diferenciació d'objectes a mil·límetres de distància fins a la nanoescala. Aquesta última precisió s'aconsegueix utilitzant la microscòpia contemporània de súper resolució, incloent la Microscopia de Localització de Molècula Única, exemples de la qual són les tècniques de microscòpia de fluorescència PALM i STORM. Aquest tipus de mètode d'obtenció d'imatges es realitza activant i desactivant estocàsticament un conjunt de molècules fluorescents distribuïdes en una mostra, prenent una fotografia de la mateixa amb una càmera CCD en cada canvi, i després processant tots els fotogrames per obtenir una imatge final. No obstant això, avui dia la precisió és de desenes de nanòmetres, el que suggereix que encara hi ha marge de millora. A més, les tècniques de súper resolució d'última generació encara presenten certs inconvenients com la superposició entre les PSF dels emissors i la dificultat de fer seguiment de la trajectòria molecular, especialment a causa de l'efecte conegut com photobleaching. És per això que recentment s'han desenvolupat algunes tècniques per millorar la microscòpia de súper resolució, com MINFLUX i DeepSTORM. MINFLUX té per objectiu reduir al mínim el nombre de fotons emesos necessaris per a la localització de les molècules amb l'objectiu principal de poder fer el seguiment molecular, mentre que DeepSTORM se centra a eliminar la superposició de les PSF utilitzant un algoritme de Deep Learning per a crear una màscara de fase (phase mask) que generi una PSF adequada per a aquest fi. En aquest projecte es combinaran les dues tècniques esperant obtenir estimacions molt precises de les posicions bidimensionals dels emissors amb resolucions d'unitats de nanòmetres, evitant alhora la superposició de PSF en mostres molt denses i reduint al mínim el nombre de fotons emesos per cada fluoròfor