Nanoscopía de fluorescencia por localización estocástica de moléculas individuales

Hasta hace unos 20 años se creía que la difracción de la luz imponía un límite fundamental de unos 200 nm a la resolución espacial de un microscopio óptico. Las nanoscopías de fluorescencia, también llamadas microscopías de superresolución, han quebrado esta barrera y permiten en teoría alcanzar la máxima resolución espacial con sentido físico, es decir el tamaño mismo de la fuente de luz. En la práctica, sin embargo, la resolución se ve limitada a unos 20 nm por efecto de variables experimentales como la relación señal-ruido y el fotoblanqueo de los marcadores fluorescentes. Además, las nanoscopías de fluorescencia mantienen las ventajas de la microscopía de fluorescencia tradicional, como el acceso poco invasivo y la alta sensibilidad y especificidad. Se denomina "localización de una molécula individual" al proceso numérico por el cual se extrae la posición de un emisor único a partir de la medición de su patrón de intensidad. La nanoscopía por localización estocástica de moléculas individuales (o simplemente "nanoscopía por localización") consiste en la adquisición secuencial de imágenes en las que en cada una un subconjunto estocástico de los fluoróforos de una muestra son resueltos individualmente. Como los patrones de emisión no se superponen, la precisión de localización solo depende del número de fotones detectados de cada emisión. La imagen final se construye con las posiciones de cada fluoróforo previamente localizado. Para obtener una imagen de superresolución es necesario que los marcadores estén separados por distancias menores a su imagen limitada por difracción y que éstos emitan de manera intermitente (que se enciendan y apaguen), de manera que en algún momento puedan observarse individualmente. La nanoscopía por localización comprende a un conjunto de técnicas diferenciadas entre sí de acuerdo al mecanismo que permite el encendido y apagado de los marcadores fluorescentes. En la presente Tesis se estudian aspectos fundamentales e instrumentales de la nanoscopía por localización y se la aplica al estudio de preguntas biológicas. En el Capítulo 1 se desarrollan los conceptos fundamentales y limitaciones de la microscopía de uorescencia, y se introducen las técnicas de superresolución. En el Capítulo 2 se detallan los métodos y estado del arte de la nanoscopía por localización. En el Capítulo 3 se caracteriza el nanoscopio por localización con posibilidad de obtener imágenes en 3D y a dos colores de emisión, que fuera construido como parte del trabajo de Tesis. Finalmente, en los Capítulos 4 y 5 se describen aplicaciones de dicho nanoscopio en dos proyectos de relevancia biológica: el estudio en neuronas hipocampales de la estructura periódica de espectrina y la distribución espacial de proteínas presentes en la membrana del Trypanosoma cruzi que median la interacción entre el parásito y el huésped