Modulation of antiviral signaling pathways by herpesviral oncoproteins

Das angeborene Immunsystem detektiert Pathogen-assoziierte molekulare Muster und initiiert schnelle Zytokin-basierte Abwehrmechanismen. So wird im Zytosol virale DNA durch den Sensor cGAS erkannt, virale RNA durch RIG-I. Diese Rezeptoren vermitteln Signale an die Adaptorprotein STING bzw. MAVS. Die Adaptoren sind in unterschiedlichem Mass von TRAF-Proteinen abhängig, um Signale an nachgeordnete Kinasen weiterzuleiten. Diese Enzyme aktivieren insbesondere IRF3 und NF- κB. Die aktivierten Transkriptionsfaktoren induzieren gemeinsam eine für die angeborene Immunantwort typische IFN-β-Produktion. Gamma-Herpesviren wie das humane Epstein-Barr-Virus (EBV) besitzen ein onkogenes Potential, das durch ihre sogenannten Onkoproteine vermittelt wird. Das primäre EBV-Onkoprotein LMP1 und auch das nahe verwandte Tio-Protein interagieren mit TRAFs um NF-κB zu aktiveren. Die gemeinsam genutzten Kofaktoren führten zur Hypothese, dass Tio und LMP1 mit den cGAS-STING- und RIG-I-MAVS-Signalübertragungswegen interferieren. Daher wurden in dieser Studie HEK293-Zellen (Wildtyp und TRAF6-knockout) verwendet für NF-κB-, IRF3- und IFN-β-Promotor-Reporterassays, IFN-β RT-qPCRs, Immunoblot- und Immunopräzipitationsanalysen. Die intrazelluläre Lokalikation wurde mittels Immunofluoreszenz-Färbung von HeLa-Zellen überprüft. Tio verstärkte die STING-vermittelte IFN-β-Aktivierung deutlich, speziell durch gesteigerte NF-κB Aktivität. Alle Effekte von STING und Tio auf IFN-β und die NF-κB-Aktivität waren TRAF6- abhängig, während die IRF3-Induktion durch STING komplett TRAF6-unabhängig und nicht von Tio beeinflusst war. Dagegen reprimierte Tio im Zusammenhang mit MAVS die IFN-β-Induktion über eine Verminderung der IRF3-Aktivität. Diese Reduktion war wieder TRAF6-abhängig. Begleitend zeigte sich, dass Tio TRAF6 aus dem mitochondrialen MAVS-Signalkomplex herauslöste und die TBK1- induzierte IRF3-Aktivierung unterbrochen wurde. Die MAVS-modulierende Wirkung basierte auf Tio’s speziellem TRAF6-Bindemotiv, welches Tio vermutlich zum dominanten TRAF6-Interaktor macht. LMP1 verstärkte ebenfalls die NF-κB- und IFN-β-Aktitivierung durch STING, beschränkte jedoch die gleichzeitige IRF3-Induktion. Das EBV-Onkoprotein reprimierte die MAVS-vermittelte IRF3- Aktivierung und IFN-β-Induktion wesentlich effizienter als Tio. Dementsprechend führte auch LMP1 zu einer Entfernung von TRAF6 aus dem mitochondrialen Signalkomplex, was für einen konservierten gamma-herpesviralen Mechanismus spricht. Die verstärkte Repression durch LMP1 ließe sich dadurch erklären, dass LMP1 zusätzlich über einen TRAF6-unabhängigen Weg die IRF3-Aktivierung und über einen TRAF6-abhängigen Weg das bereits aktivierte IRF3 hemmte. Außerdem wurde LMP1 im Komplex mit IRF3 nachgewiesen, was auf weitere Mechanismen zur Modulation von IRF3 hindeutet. Insgesamt wurde in dieser Studie die bisher unbekannte Funktion herpesviraler Onkoproteine als Immunregulatoren beschrieben, welche die Immunantwort des Wirtes formen und eine für die virale Persistenz vorteilhafte Mikroumgebung schaffen könnten. Im Hinblick auf LMP1 könnte sich daraus ein Beitrag zum besseren Verständnis der EBV-Latenz ergeben.The innate immune system detects pathogen-associated molecular patterns and immediately initiates cytokine-based defense mechanisms. In the cytosol, viral DNA is recognized by the sensor protein cGAS, whereas viral RNA is sensed by RIG-I. These receptors transmit signals to the adaptor proteins STING and MAVS, respectively. The adaptors, to a variable extent, rely on TRAF proteins to transmit signals to downstream kinases that activate, most prominently, IRF3 and NF-κB. The activated transcription factors cooperate to induce the innate immune response characterized by IFN-β production. Gamma-herpesviruses like the human Epstein-Barr virus (EBV) possess an oncogenic potential that is mediated by their so-called oncoproteins. The primary EBV oncoprotein, LMP1, and the closely related herpesvirus oncoprotein Tio interact with TRAFs to activate NF-κB. Based on the shared signaling intermediates, this study addressed the hypothesis that Tio and LMP1 can interfere with the cGAS-STING and RIG-I-MAVS pathways. Therefore, HEK293 wildtype and TRAF6 knockout cells were used for NF-κB, IRF3 and IFN-β-promoter reporter assays, IFN-β RT-qPCRs, immunoblotting and immunoprecipitation analyses. Intracellular localization was studied by immunofluorescence staining of HeLa cells. Tio strongly enhanced STING-mediated IFN-β activation by amplifying the underlying NF-κB activity. All effects of STING and Tio on IFN-β as well as NF-κB activity were TRAF6 dependent, whereas IRF3 induction by STING was completely TRAF6 independent and unaffected by Tio. In the context of MAVS signaling, Tio repressed IFN-β induction by decreasing the underlying IRF3 activity. This impairment was again TRAF6 dependent. Mechanistically, Tio was found to detach TRAF6 from the mitochondrial MAVS signaling complex, thereby disrupting the TBK1-induced IRF3 activation. Modulation of MAVS signaling relied on Tio’s distinct TRAF6-binding motif, likely making Tio the dominant interactor of TRAF6. LMP1 also enhanced STING signaling towards NF-κB and IFN-β activation but restrained the concomitant IRF3 induction. The EBV oncoprotein LMP1 repressed MAVS-mediated IRF3 activation and IFN-β induction more efficiently than Tio. Accordingly, the relocation of TRAF6 from the mitochondrial signaling complex was also observed for LMP1, indicating a conserved gamma-herpesviral mechanism. In addition, LMP1 was found to employ a TRAF6-independent mechanism to repress IRF3 activation, and a TRAF6-dependent mechanism to directly interfere with activated IRF3, possibly explaining the stronger repression relative to Tio. Furthermore, LMP1 was detected in complex with IRF3, pointing at potential accessory mechanisms to modulate IRF3 activity. Together, the results of this study highlight a novel function of herpesviral oncoproteins as immune regulators, distinctly shaping host immune responses and possibly resulting in a microenvironment beneficial for viral persistence. In terms of LMP1, these findings could contribute towards a better understanding of the maintenance of EBV latenc