Inhibition of programmed cell death an proinflammatory signals by the cytomegalovirus protein M45

Die angeborene Immunität ist entstanden als Schutz gegenüber einer Vielzahl schädigender Einflüsse, denen ein Organismus ausgesetzt ist, und dient im Besonderen der sofortigen Abwehr von Krankheitserregern. Sie basiert auf der Funktion verschiedener keimbahnkodierter Rezeptoren und Sensoren, wie etwa den Toll-like Rezeptoren, die bestimmte fremdartige Strukturen der Krankheitserreger erkennen und daraufhin diverse Immunabwehrmechanismen auslösen. Hierbei kann die Detektion der Fremdstrukturen zum einen über die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, wie AP-1, NF-kB und IRFs, die Produktion antiviraler und proinflammatorischer Zytokine verursachen, welche daraufhin auf andere Zellen einwirken. Zum anderen kann die Detektion der Fremdstrukturen auch direkte immunologische Effektorfunktionen in der betroffenen Zelle auslösen. Die diversen Signale der Zytokin- und Detektionsrezeptoren münden in gemeinsamen Signalwegen, die daraufhin zur Induktion der verschiedenen Immuneffektorfunktionen führen. Häufig kommt es zunächst zu einer Aktivierung von NF-kB, was der antiviralen Abwehr, der Beseitigung anderer Störungen und dem Überleben der Zelle unter Stress dient. Wenn der schädigende Einfluss zu lange anhält, kann es stattdessen zur Initiation des programmierten Zelltodes kommen. Der programmierte Zelltod wird als sehr effektive Abwehrstrategie vielzelliger Organismen betrachtet, welcher die Ausbreitung intrazellulärer Erreger im Körper verhindert. Dies beruht darauf, dass die betroffene Zelle abstirbt, bevor der Erreger in der Lage ist, sich zu vervielfältigen und auf benachbarte Zellen zu übertragen. Da Viren als intrazelluläre Parasiten jedoch auf den Metabolismus ihrer Wirtszellen angewiesen sind, mussten sie im Laufe ihrer Evolution vielseitige Immunevasionsfunktionen etablieren, um sich trotz der effektiven antiviralen Wirksamkeit der angeborenen Immunität in den Wirtszellen vermehren zu können. In dieser Arbeit konnte ein vielseitiger Immunevasionsmechanismus des murinen Cytomegalovirus aufgedeckt werden. Am Anfang der Arbeit stand die Beobachtung, dass rekombinante murine Cytomegaloviren, die kein funktionsfähiges M45-Protein exprimieren, nicht mehr in der Lage waren, sich in Endothelzellkulturen auszubreiten, was auf die vorzeitige Induktion des programmierten Zelltodes zurückgeführt wurde. Der Mechanismus, wie das murine Cytomegalovirus-Protein M45 die Einleitung des programmierten Zelltodes verhindert, sollte in dieser Arbeit aufgeklärt werden. In ersten Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass M45 tatsächlich in der Lage ist, infizierte Zellen vor Todesrezeptor-vermitteltem Zelltod zu schützen. Über die Analyse von M45-Interaktionspartnern wurde daraufhin aufgedeckt, dass M45 das zentrale zelluläre Adapterprotein RIP1 angreift, welches an einem Schnittpunkt verschiedener immunologischer Detektionssysteme und Zytokinsignalwege steht. Durch die Bindung an 5 RIP1 kann M45 die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB nach Stimulation des TLR3 unterbinden, was wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Detektion einer CMV-Infektion spielt. Des Weiteren inhibiert M45 die Aktivierung von NF-kB und der p38 MAP-Kinase nach TNF-a-Stimulation. Die vermutlich wichtigste Funktion hingegen, die M45 durch die Inhibition von RIP1 ausübt, ist die Verhinderung des Caspase-unabhängigen programmierten Zelltodes infizierter Zellen nach Einwirkung von TNF-a. Diese Funktion erklärt den ursprünglich beobachteten Phänotyp der M45-Deletionsmutante. Es konnte gezeigt werden, dass M45 diese wichtigen Immunevasionsfunktionen allein ohne weitere virale Proteine erfüllen kann. Sowohl für die Bindung an RIP1 als auch für die Inhibition der TNF-a-induzierten NF-kB-Aktivierung scheint nur der C-terminale Teil des M45 benötigt zu werden. Als molekulare Grundlage konnte nachgewiesen werden, dass M45 die Ubiquitinierung von RIP1 verhindert, welche als Stimulus-abhängige Aktivierung dieses Adapterproteins betrachtet wird. Auf diese Weise werden die verschiedenen RIP1- abhängigen Signalwege von M45 blockiert. Diese Inhibition RIP1-abhängiger Signalwege durch das MCMV-Protein M45 stellt einen neuen viralen Evasionsmechanismus dar, mit dem gleichzeitig mehrere antivirale und proinflammatorische Signalwege inhibiert werden können und der vermutlich entscheidend zur erfolgreichen Vermehrung und Pathogenese des murinen Cytomegalovirus beiträgt.Innate immunity has evolved as protection against the multitude of harmful influences which an organism encounters and serves in particular the immediate defence against pathogens. It is based on different germ line-encoded receptors and sensors, as for example Toll-like receptors, which detect specific foreign structures on pathogens and activate diverse immune defence mechanisms. On the one hand the detection of foreign structures can lead via activation of transcription factors such as NF-kB, AP-1 and IRFs to the production of proinflammatory and antiviral cytokines, which in turn act on neighbouring cells. On the other hand the detection of foreign structures can cause direct immunological effector functions in the primary cell. The various signals of detection and cytokine receptors combine in common signalling pathways which induce different immune effector functions. This usually results in initial activation of NF-kB, which serves the antiviral defence, the elimination of other disturbances and the survival of the cell under stress. When the harmful impact lasts too long, it can result instead in the initiation of programmed cell death. Programmed cell death is regarded as very effective defence strategy of multicellular organisms which anticipates the spread of intracellular pathogens in the body. This is based on the fact that the infected cell dies before the pathogen is able to proliferate and spread to neighbouring cells. 6 Since viruses as intracellular pathogens rely on the host cell’s metabolism, they had to establish miscellaneous immune evasion mechanisms during their evolution, to be able to replicate in host cells regardless of the effective antiviral potency of innate immunity. This study revealed an impressively versatile immune evasion mechanism of murine cytomegalovirus. The project is based on the initial observation that recombinant murine cytomegaloviruses which lack a functional M45 protein were not anymore able to replicate in endothelial cell cultures, which was attributed to premature initiation of programmed cell death. The aim of this study was to reveal the mechanism how the murine cytomegalovirus protein M45 prevents the induction of programmed cell death. First experiments confirmed that M45 was able to protect infected cells from death receptor induced programmed cell death. Through the analysis of M45 interaction partners it was discovered that M45 impedes the cellular adapter protein RIP1, which stands at the intersection of different immunological detection systems and cytokine signalling pathways. Through binding to RIP1 M45 is able to prevent the activation of NF-kB after stimulation of TLR3, which probably plays an important role for the detection of cytomegalovirus infections. Furthermore M45 inhibits the activation of NF-kB and the p38 MAP kinase after stimulation with TNF-a. However the presumably most important function which M45 fulfils by interacting with RIP1 is the inhibition of TNF-a induced caspase-independent programmed cell death of infected cells. This function accounts for the originally observed phenotype of the M45 deletion mutant. It has been shown that M45 is able to fulfil this function on its own without other viral proteins. For the binding to RIP1 as well as for the inhibition of TNF-a-induced NF-kB activation just the C-terminal part of M45 seems to be necessary. As molecular basis it was found that M45 inhibits the ubiquitination of RIP1 which is considered as stimulus-dependent activation of this adapter protein. In this way the different RIP1-dependent signalling cascades are blocked. This inhibition of RIP1-dependent signalling pathways by the MCMV protein M45 presents a new viral immune evasion mechanism, which inhibits several antiviral and proinflammatory signalling cascades at once and which probably contributes decisively to successful propagation and pathogenesis of murine Cytomegalovirus