Biochemische Untersuchungen von Glykolyse-Enzymen des thermoacidophilen Crenarchaeoten Sulfolobus solfataricus

Within the Sulfolobus Systems Biology (“SulfoSYS”) project the effect of temperature on a metabolic network is investigated at transcriptomic, metabolomic, proteomic and enzyme level. S. solfataricus utilizes an unusual branched Entner-Doudoroff (ED) pathway for sugar degradation that is promiscuous for glucose and galactose. As a part of the SulfoSYS project, this work focuses on the characterization of the following enzymes: glucose dehydrogenase (GDH-2, SSO3204), phosphoglycerate mutases (iPGAM, SSO0417 and dPGM, SSO2236), enolase (ENO, SSO0913), pyruvate kinase (PK, SSO0981), phosphoenolpyruvate synthetase (PEPS, SSO0831), pyruvate dikinase (PPDK, SSO2820) comprising cloning, expression and detailed analysis at different temperatures ranging from 50°C to 88°C. Furthermore, cell free extracts of S.solfataricus cells, grown at the temperatures 65°C, 70°C and 80°C, were prepared and analyzed for activity. In addition, temperature dependent stability of metabolic intermediates was detrmined. GDH-2, ENO, PK and PEPS, only annotated as putative enzymes in the S. Solfataricus genome, were confirmed as functional enzymes and characterized in detail. S. solfataricus iPGAM was confirmed to exhibit activity in the anabolic direction in addition to the already known catabolic direction. The comparison of kinetic parameters suggests that GDH-2 might represent the major player in glucose catabolism via the branched ED pathway, while GDH-1 might have a role in the degradation of a variant of different sugars. The kinetic parameters of iPGAM, ENO, PK and PEPS show interesting trends regarding temperature change. Each enzyme behaves differently to changing temperature. It was shown that the metabolic intermediates PEP, NADH and NADPH are heat instable. Therefore a metabolic thermoadaptation strategy is essential for the organism. These findings, combined with the fact that the enzymes ENO and iPGAM have a different preference for the anabolic and the catabolic direction of the respective reaction, suggests a metabolic thermo adaptation by the control of flux of intermediates. The PEP producing step (ENO) is slowed down at higher temperatures while the PEP consuming step (PK) is accelerated at the same time, resulting in a relatively small amount of PEP at higher temperatures. Additionally, the PEP conversion to 2-PG by ENO is preferred at high temperatures. With changing catalytic parameters at different temperatures, this might allow the organism to keep pools of heat instable compounds small in order to avoid their decay. Furthermore, cell free extracts of S. solfataricus cells, grown at the temperatures 65°C, 70°C and 80°C, were analyzed for activity and in addition the temperature dependent stability of metabolic intermediates was investigated. Considering the general trend of substrate and co-substrate usage of the GDH reaction in S. solfataricus crude extracts it can be suggested that at least a third GDH isoenzyme or a specific galactose dehydrogenase is present in SSO. Kinetic data of activities in crude extracts, as well as of recombinant expressed enzymes were used to establish the first kinetic CCM model for an archaeal thermoacidophilic organism, which can be found at the following link: http://jjj.biochem.sun.ac.za/sysmo/models/Sulfo-Sys/index.html Im Rahmen des Sulfosys-Projekts wird die Auswirkung von Temperaturänderung auf ein metabolisches netzwerk auf Transcriptom, Metabolom, Proteom und Enzymebene untersucht. S. solfataricus nutzt einen ungewöhnlich verzweigten Entner-Doudoroff (ED) Weg für den Zuckerabbau, der sowohl Glukose als auch Galaktose verarbeitet. Als Teil des SulfoSYS-Projekts konzentriert sich diese Arbeit auf die Charakterisierung der folgenden Enzyme Glucose-Dehydrogenase (GDH-2, SSO3204), Phosphoglycerat Mutasen (iPGAM, SSO0417 und dPGM, SSO2236), Enolase (ENO, SSO0913), Pyruvatkinase (PK, SSO0981), Phosphoenolpyruvat-Synthetase (PEPS, SSO0831), Pyruvat Dikinase (PPDK, SSO2820), bestehend aus Klonierung, Expression und detallierter Analyse der Aktivität bei verschiedenen Temperaturen zwischen 50°C bis 88°C. Darüber hinaus wurden zellfreie Extrakte aus S. solfataricus Zellen hergestellt die bei den Temperaturen 65°C, 70°C und 80°C gewachsen sind und auf Enzymaktivitäten hin untersucht. Des Weiteren wurden temperaturabhängige Stabilitäten von Intermediaten bestimmt. GDH-2, ENO, PK und PEPS waren nur als putative enzyme im S. solfataricus Genom annotiert, diese wurden im Detail charakterisiert und konnten in dieser Arbeit als funktionelle Enzyme bestätigt werden. Für die S. solfataricus iPGAM konnte gezeigt werden dass diese zusätzlich zur bereits bekannten katabolen auch in die anabole Richtung aktiv ist. Der Vergleich kinetischer Parameter zeigt, dass GDH-2 den Grossteil der Verarbeitung von Glukose übernimmt, während GDH-1 flexibler ist und eine ganze Reihe an verschiedenen Zuckern als Substrat nutzt. Die kinetischen Parameter von iPGAM, ENO, PK und PEPS weisen interessante Trends bezüglich der Temperaturänderung auf und zeigen dass jedes der untersuchten Enzyme unterschiedlich auf die Änderung der Temperatur reagiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Intermediate PEP, NADH und NADPH hitzelabil sind, wodurch eine metabolische Thermoadaptionsstrategie für den Organismus S. solfataricus notwendig ist. Diese Erkentnisse und die Tasache, dass iPGAM und ENO unterschiedliche Präferenzen in anaboler und kataboler Richtung der Enzymreaktion aufweisen, legt eine Anpassung an hohe Temperaturen nahe, bei der der Flux von hitzelabilen Intermediaten gesteuert wird. Die Produktion von PEP durch ENO wird bei hohen Temperaturen verlangsamt und gleichermassen die umwandlung von PEP zu pyruvat beschleunigt, wodurch kleinere Mengen des hitzelabilen Intermdiats PEP der hohen Temperatur ausgesetzt sind. Darüber hinaus wird die anabole Reaktion von PEP hin zum hitzestabilen 2-PG bei höheren Temperaturen bevorzugt. Die Untersuchungen der zellfreien Extrakte von S. solfataricus Zellen weist eine Substrat und Co-substratnutzung der GDH-Reaktion auf, die vermuten lässt das noch ein weiteres Enzym an dieser Reaktion beteiligt ist, möglicherweise eine Galaktose Dehydrogenase oder ein drittes GDH-Isoenzym. Die kinetischen Parameter aus zellfreien Extrakten und rekombinant exprimierten Enzymen wurden zur erstellung des ersten kinetischen ZKM Modell für einen thermoacidophilen Archaeum verwendet. Ziel des Projektes ist, eine ausreichend präzise Nachbildung des ZKM von S. solfataricus („Silicon Cell“) zu erstellen, die es erlaubt, die Robustheit des Netzwerkes gegenüber Temperaturveränderungen zu berechnen und modellieren. Das Modell ist unter folgendem Link zu finden: http://jjj.biochem.sun.ac.za/sysmo/models/Sulfo-Sys/index.htm