Komponenten und Wege von post-Golgi Vesikeln beim Transport zur apikalen Plasmamembran

The plasma membrane of epithelial cells shows an asymmetric organization, characterized by a functionally and morphologically distinct apical and basolateral domain. This polarity is a prerequisite for the integrity of an epithelial tissue and for the directional transport. The establishment and the maintenance of cellular polarity depend on a highly specialized cellular sorting and transport machinery. Microtubules are an important component of this transport machinery and they provide tracks for the vesicular transport. Important features of microtubules are diverse posttranslational modifications. The detyrosination represents a form of modification that occurs on the C-terminus of α-tubulin. Within the tyrosination/detyrosination-cycle the tyrosine is removed by a vasohibin/chaperon complex and subsequently re-added by tubulin tyrosine ligase (TTL). As part of this work, the influence of tubulin detyrosination on cellular polarity of MDCK kidney epithelial cells was studied. Knocking out TTL resulted in a dramatically increase in the level of detyrosinated tubulin as well as acetylated tubulin. Changing tubulin contents towards detyrosinated or tyrosinated microtubules by modulating TTL expression affected the epithelial morphology. Interestingly, TTL knockout cells were more mobile than cells overexpressing TTL. Furthermore, detyrosinated microtubule possibly influenced the number and size of focal adhesions. The presented observations indicate that a dynamic adaptation of detyrosinated and tyrosinated microtubules is essential for the regulation of cellular polarization, migration and adhesion. Beside microtubules, the sorting and transport machinery consist of a diverse set of proteins, which are crucial for cargo delivery to the correct membrane domain. These include motor proteins, adaptor proteins, lectins, Rab-GTPases and cargo molecules. Among these components, the large GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1), a member of the dynamin superfamily, was identified on apical post-Golgi vesicles. Mx- proteins are known as interferon induced proteins, which are expressed after viral infection. In MDCK cells, Mx1 shows no antiviral activity and is constitutively expressed. Mx-proteins exhibit many characteristic properties that suggest functions in basic cellular processes. The large GTPase was identified as an important regulatory component of the apical transport system. Thereby, the large GTPase associates with compartments of the early and late secretory pathway. Since vesicular structures positive for Mx1 are highly dynamic, the influence of the microtubule cytoskeleton on this motility was studied using live cell imaging. Microtubule disruption induced by nocodazole, inhibits long-range trafficking. Using biochemical and fluorescence microscopic methods, the association of canine Mx1 with α-tubulin was verified. Furthermore, it was demonstrated for the first time that Mx1 interacts with the motor protein Kif5B. In agreement with these observations the knockout of Mx1 or mutation in the membrane interaction motif of the unstructured L4 loop decreased the efficiency of apical cargo delivery. The L4 loop mutant still interacts with Kif5B, however the mutation causes elongation of Mx1-positive compartments. It is thus conceivable that Mx1 functions in the fission of transport vesicles based on structural similarities to classical dynamins. For the first time, this work shows a functional role of the large GTPase Mx1 in the apical protein trafficking. Mx1 not only stabilizes the interaction between Kif5B, microtubules and apical transport carriers, but also aids in vesicle fission.Die Plasmamembran von polaren Epithelzellen besitzt eine asymmetrische Organisation, die durch eine funktionell und morphologisch unterscheidbare apikale und basolaterale Domäne charakterisiert ist. Diese Polarität ist Voraussetzung für die Integrität des Epithelgewebes und den gerichteten Proteintransport. Die Entstehung und Aufrechterhaltung der zellulären Polarität hängt von einer hochspezialisierten zellulären Sortier- und Transportmaschinerie ab. Die Mikrotubuli sind ein wichtiger Bestandteil der Transportmaschinerie und stellen die Transportwege für die Beförderung von Vesikeln bereit. Wichtige Merkmale von Mikrotubuli sind die vielfältigen posttranslationalen Modifikationen. Eine dieser Modifikationen stellt die Detyrosinierung am C-Terminus des α-Tubulins dar. Im Kreislauf der Tyrosinierung und Detyrosinierung wird dieses Tyrosin durch einen Vasohibin/ Chaperon-Komplex entfernt und kann durch die Tubulin Tyrosin Ligase (TTL) wieder angefügt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss der Detyrosinierung auf die Zellpolarität von MDCK-Zellen, Epithelzellen der Hundeniere, untersucht. Der TTL- Knockout führte zu einer dramatischen Erhöhung der detyrosinierten Tubulin-Menge sowie zu einem Anstieg an acetyliertem Tubulin. Die Veränderung des Tubulin-Gehalts hin zu detyrosiniertem oder tyrosiniertem Tubulin durch Modulation der TTL-Expression beeinflusste die epitheliale Morphologie der Zellen. Interessanterweise waren TTL-Knockout Zellen mobiler als TTL-überexprimierende Zellen. Darüber hinaus scheinen detyrosinierte Mikrotubuli die Anzahl und Größe von fokalen Adhäsionen zu beeinflussen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine dynamische Anpassung von detyrosinierten und tyrosinierten Mikrotubuli für den regulierten Ablauf der Zellpolarisierung, der Migration sowie der Adhäsion essentiell ist. Neben Mikrotubuli besteht die Sortier- und Transportmaschinerie aus einem breiten Spektrum bestimmter Proteine, die für die Sortierung und Beförderung zur jeweiligen Membrandomäne wichtig sind. Dazu zählen Motorproteine, Adapterproteine, Lektine, Rab-Proteinen und die zu transportierenden Proteine. Darunter befindet sich auch die große GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1), ein Mitglied der Dynamin- Superfamilie. Dieses Protein wurde auf apikalen post-Golgi Vesikeln identifiziert. Mx- Proteine gelten als streng Interferon-reguliert, die nur nach einer viralen Infektion exprimiert werden. In MDCK-Zellen besitzt Mx1 keine antivirale Aktivität und es wird konstitutiv exprimiert. Viele charakteristische Eigenschaften der Mx-Proteine lassen auf eine Funktion in grundlegenden, zellulären Prozessen schließen. So wurde die große GTPase als wichtige regulatorische Komponente des apikalen Transportsystems identifiziert. Dabei befindet sich die große GTPase auf frühen und späten sekretorischen Kompartimenten. Da Mx1-positive Strukturen sehr beweglich sind und ein dynamisches Verhalten aufweisen, wurde mit Hilfe von Lebendzellaufnahmen die Dynamik dieser Strukturen in Abhängigkeit des Mikrotubuli-Zytoskeletts untersucht. Die Depolymerisation der Mikrotubuli durch Nocodazol führte zu einem eingeschränkten Langstreckentransport. Mittels biochemischer und fluoreszenzmikroskopischer Methoden war es möglich, die Assoziation von caninem Mx1 mit α-Tubulin nachzuweisen. Außerdem konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Mx1 mit dem Kinesin- Motorprotein Kif5B interagiert. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung führte der Knockout von Mx1 oder die Mutation im Membraninteraktions-Motiv der unstrukturierten L4-Schleifenregion zu einem verminderten apikalen Proteintransport. Diese Mx1-Mutante war trotz mutiertem Membraninteraktions-Motiv in der Lage an Kif5B zu binden. Jedoch führte die Mutation zur Elongation der Mx1-positiven Kompartimente. Es ist daher denkbar, dass Mx1 aufgrund der Strukturähnlichkeiten mit den klassischen Dynaminen auch eine Funktion in der Abschnürung von Transportvesikeln besitzt. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die funktionale Rolle der großen GTPase Mx1 im apikalen Proteintransport aufgezeigt werden. Mx1 stabilisiert nicht nur die Assoziation zwischen Kif5B, den Mikrotubuli und apikalen Transportvesikeln sondern unterstützt auch die Vesikelfission