Der molekulare Mechanismus der Galektin-3-Rekrutierung in Multivesikuläre Körperchen zur polarisierten exosomalen Sekretion

The encapsulating tissue of all inner and outer body surfaces is formed by epithelial cells, which share a characteristic structure divided in an apical and a basolateral cell pole. Polar protein transport is essential for directional transport and integrity of the epithelial tissue. An essential element here are sorting receptors, to which the β-galactoside binding protein galectin-3 belongs. This lectin, while residing in an endosomal compartment, sorts and crosslinks glycoproteins to high-molecular weight clusters, thereby directing them to the apical cell pole. In addition to the localization in the endosome, extracellular galectin-3 has a key role in important processes such as immunomodulation or signal transduction. As a modulator, galectin-3 therefore has decisive influences on tumor progression, in particular angiogenesis, as well as cell adhesion, cell motility, and cell invasion. Galectin-3 does not carry a signal sequence that could provide for sorting into the classical, secretory pathway which is typical for extracellular proteins and is exported independently of the endoplasmic reticulum / Golgi apparatus. In this context, this process is called unconventional protein secretion. The underlying biochemical secretion mechanism responsible for the secretion of Galectin-3 and the corresponding sorting signals have not yet been described. In this work, Galectin-3 could be detected exclusively in the lumen of apically secreted exosomes. Using ultrastructural analysis based on super-resolution light microscopy and electron microscopy, the process of Galectin-3 sorting could be visualized in unprecedented resolution. This sorting process was observed on the surface of specialized endosomal compartments, the multivesicular bodies. The mechanism consisted of the recruitment, sorting, and packaging of galectin-3 into intraluminal vesicles. In addition, computer-aided simulations of the three distinct budding stages were performed to validate the ultrastructural data and evaluate the localization precision achieved. The sorting and pinching process requires a special super complex, appropriately called the ESCRT complex (for Endosomal Sorting Complex required for Transport). Knockdown of the key component Tsg101, the use of a specific inhibitor and the expression of a dominant-negative mutant of the AAA ATPase Vps4a prevented the exosomal secretion of galectin-3. This resulted in an intracellular accumulation on the limiting membrane of the multivesicular bodies. An in silico gene analysis of 34 vertebrates identified a highly conserved tetrapeptide PSAP in the N-terminus of galectin-3, which was also found to be subject to convergent evolution across species. For the first time, it was shown that this PSAP domain allows galectin-3 to bind directly to Tsg101. This direct interaction triggers subsequent sorting and finally exosomal secretion. Accordingly, the direct interaction can be interrupted by the mutation PSAP → ASAA, resulting in a significant reduction of exosomal galectin-3 secretion. Remarkably, the PSAP sorting signal can be transferred to the neutral, exogenously introduced green fluorescent protein (GFP), so that GFP-PSAP was exosomally secreted, in contrast to wild-type GFP. The process of galectin-3 secretion is thus in direct analogy to the viral release of certain enveloped viruses, such as HIV, Ebola, and Marburg virus, which recruit the ESCRT complex using the PSAP domain to bud directly from the plasma membrane. In addition, there was evidence for a possible functional role of galectin-3 in the secretion of exosomal marker proteins. Galectin-3 could thus define a new group of endogenous proteins that do not belong to the ESCRT super complex, but which are exosomally secreted by the labeling with the PSAP motif. This work thus identifies a unique model of how endogenous cargo proteins can be recruited for exosomal secretion by a PSAP-mediated direct interaction with Tsg101. This provides new possibilities for the polarized unconventional secretion of cytoplasmic proteins, which could also be used in biomedical practice in the future.Das Deckgewebe aller inneren und äußeren Körperoberflächen wird aus epithelialen Zellen gebildet, denen eine charakteristische Gliederung in einen apikalen und einen basolateralen Zelllpol gemein ist. Für den gerichteten Stofftransport und für die Integrität des Epithelgewebes ist der polare Proteintransport essenziell. Ein wesentliches Element stellen dabei Sortierrezeptoren dar, zu denen das β-Galaktosid-bindende Protein Galektin-3 gehört. Dieses Lektin sortiert und verbindet Glykoproteine in einem endosomalen Kompartiment zu hochmolekularen Clustern und dirigiert diese dadurch an den apikalen Zellpol. Neben der Lokalisation im Endosom verfügt Galektin-3 im extrazellulären Raum über eine Schlüsselrolle in bedeutenden Prozessen wie der Immunmodulation oder der Signaltransduktion. Galektin-3 hat als Modulator folglich entscheidende Einflüsse auf die Tumorprogression, insbesondere die Angiogenese, sowie die Zelladhäsion, -Motilität und -Invasion. Galektin-3 trägt in sich keine Signal-Sequenz, die für eine Einsortierung in den klassischen, sekretorischen Weg für extrazelluläre Proteine sorgen könnte und wird unabhängig von dem Endoplasmatischen Retikulum/Golgi-Apparat exportiert. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von einer unkonventionellen Proteinsekretion. Sowohl der zugrundeliegende, biochemische Sekretionsmechanismus, der für die Sekretion von Galektin-3 verantwortlich ist, als auch die entsprechenden Sortiersignale sind bislang noch gänzlich unbekannt. In dieser Arbeit konnte Galektin-3 exklusiv im Lumen apikal sekretierter Exosomen nachgewiesen werden. Mithilfe ultrastruktureller Analysen, die einerseits auf der ultrahochauflösenden Lichtmikroskopie und andererseits auf der Elektronenmikroskopie aufbauten, konnte der Prozess der Galektin-3-Sortierung in bisher unerreichter Auflösung visualisiert werden. Dieser Prozess erfolgte an spezialisierten endosomalen Kompartimenten, den Multivesikulären Körperchen, und bestand aus der Rekrutierung, Sortierung und der Verpackung von Galektin-3 in intraluminale Vesikel. Außerdem wurden Computer-gestützte Simulationen der drei distinkten Abknospungsstadien erstellt, um die ultrastrukturellen Daten abzusichern und um die erreichte Lokalisations-Präzision zu bewerten. Für den Sortier- und Abschnürungsprozess wird ein spezieller Superkomplex benötigt, der passenderweise ESCRT-Komplex heißt (für Endosomal Sorting Complex required for Transport). Durch den Knockdown der Schlüsselkomponente Tsg101, die Verwendung eines spezifischen Inhibitors, sowie die Expression einer dominant-negativ wirkenden Mutante der AAA-ATPase Vps4a, konnte die exosomale Sekretion von Galektin-3 unterbunden werden. Dies führte in der Folge zu einer intrazellulären Akkumulation auf der begrenzenden Membran der Multivesikulären Körperchen. Durch eine in silico Gen-Analyse von 34 Wirbeltieren konnte ein hoch konserviertes Tetrapeptidmotiv PSAP im N-Terminus von Galektin-3 identifiziert werden, das zudem speziesübergreifend in bestimmten Abschnitten offensichtlich einer konvergenten Evolution unterlag. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass diese PSAP-Domäne Galektin-3 die direkte Bindung an Tsg101 ermöglicht. Durch diese direkte Interaktion werden die nachfolgende Sortierung und schließlich die exosomale Sekretion ausgelöst. Dementsprechend kann die direkte Interaktion durch die Mutation PSAP→ASAA unterbrochen werden, was zu einer erheblichen Verringerung der exosomalen Galektin-3-Sekretion führt. Bemerkenswerterweise konnte das PSAP-Sortiersignal auf das neutrale, exogen eingebrachte grün fluoreszierende Protein (GFP) übertragen werden, sodass GFP-PSAP im Gegensatz zum Wildtyp-GFP nunmehr exosomal sekretiert wurde. Der Prozess der Galektin-3-Sekretion steht damit in direkter Analogie zur viralen Freisetzung bestimmter behüllter Viren, wie z. B. dem Humanen Immundefizienz-, Ebola- und Marburg-Virus, die mithilfe der PSAP-Domäne den ESCRT-Komplex rekrutieren und direkt von der Plasmamembran abknospen können. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf eine mögliche funktionelle Rolle von Galektin-3 in der Sekretion von exosomalen Markerproteinen. Galektin-3 könnte somit eine neue Gruppe von endogenen Proteinen definieren, die nicht zum ESCRT-Superkomplex gehören und die durch die Markierung mit dem PSAP-Motiv exosomal sekretiert werden. Diese Arbeit konzipiert somit ein einzigartiges Modell, wie endogene Cargoproteine durch die PSAP-vermittelte direkte Interaktion mit Tsg101 für die exosomale Sekretion rekrutiert werden können. Dies eröffnet zudem neue Möglichkeiten für die polarisierte unkonventionelle Sekretion von zytoplasmatischen Proteinen, die in der Zukunft auch in der biomedizinischen Praxis Anwendung finden könnten