Bacterial factors involved in the intramacrophage survival of Pseudomonas aeruginosa and search for specific inhibitors : from the cellular model to the vertebrate Danio rerio model

Pseudomonas aeruginosa, fait partie des bactéries pathogènes classées par l’OMS «hautement prioritaires», résistantes aux antibiotiques et pour lesquelles il est urgent d’identifier de nouveaux moyens de lutte. P. aeruginosa, responsable d’infections aiguës ou chroniques, est impliqué dans des infections nosocomiales et est également le principal pathogène responsable de la morbidité et la mortalité des patients atteints de mucoviscidose, maladie génétique à transmission récessive, liée à des mutations du gène cftr. Le macrophage est en première ligne de la défense immunitaire innée. Le rôle dans l’infection de la capacité de P. aeruginosa à résister à l’action bactéricide des macrophages est un aspect mal connu, que ce soit dans le contexte de la mucoviscidose ou pas. Des facteurs de virulence comme MgtC et OprF, ont récemment été identifiés comme important dans la survie intramacrophagique de P. aeruginosa. Notre projet a pour objectif principal de mieux comprendre le rôle de ces facteurs dans l’établissement de l’infection à P. aeruginosa, de tester la contribution du canal CFTR à ce niveau, et de développer une stratégie thérapeutique innovante. L’intérêt étant de mieux contrôler l’infection, nous proposons de développer une nouvelle stratégie, en complément de l’antibiothérapie, qui vise à limiter la capacité de P. aeruginosa à survivre dans le macrophage. Cette approche se base sur la cible MgtC et un inhibiteur naturel MgtR. Nous avons testé ici pour la première fois, l’effet d’un peptide synthétique MgtR sur P. aeruginosa. MgtR réduit la survie bactérienne dans les macrophages, via son effet sur la protéine MgtC, validant ainsi, l’effet biologique du peptide synthétique. Cette approche antivirulence est couplée à une approche structurale, afin de caractériser l’interaction MgtC/MgtR d’un point de vue moléculaire et d’étudier l’effet de MgtR sur la dimérisation de MgtC. Ceci pourrait permettre in fine d’optimiser le peptide MgtR afin de pouvoir le tester dans un modèle animal (des études préliminaires dans l’embryon de poisson-zèbre s’étant avérées infructueuses). J’ai de plus contribué à une étude visant à caractériser les facteurs bactériens de P. aeruginosa impliqués dans le stade intramacrophagique. Ces travaux ont montré l’implication de MgtC et OprF dans l’expression du SST3, lui-même responsable d’un phénomène de lyse des macrophages par les bactéries intracellulaires. L’utilisation du mutant oprF comme « indicateur » du rôle intramacrophagique in vivo, nous a permis de montrer l’importance de l’action bactéricide du macrophage (e.g. l’acidification du phagosome) dans le contrôle de l’infection à P. aeruginosa, dans des macrophages en culture et dans l’embryon de poisson-zèbre. Ce modèle vertébré est pertinent non seulement pour l’étude de l’infection à P. aeruginosa, mais également pour l’implication du CFTR. Les embryons cftr-/- semblent être particulièrement susceptibles à l’infection par P. aeruginosa, et ce modèle pourrait permettre de déterminer la contribution spécifique du CFTR à l’action bactéricide du macrophage. En conclusion, une meilleure compréhension de la phase intramacrophagique de P. aeruginosa et des facteurs bactériens impliqués, pourraient permettre de mieux contrôler l’infection à P. aeruginosa.The increased number of antibiotic-resistant bacteria is a real challenge for medical research. WHO has published a list of very high priority pathogens, which includes Pseudomonas aeruginosa, a bacterium responsible for acute and chronic infections. P. aeruginosa is involved in nosocomial infections and is also the main pathogen responsible of the morbidity and mortality of patients with cystic fibrosis, a genetic disorder caused by mutations in the cftr gene.The macrophage is in the first line of the innate immune defense. The role during infection of the ability of P. aeruginosa to resist to the bactericidal action of macrophages is poorly understood, both in the context of cystic fibrosis or in normal conditions. Virulence factors such as MgtC and OprF have been recently identified as important in the intramacrophage survival of P. aeruginosa. The main objective of our project is to better understand the role of these factors in the establishment of P. aeruginosa infection, to test the contribution of the CFTR channel at this stage, and to develop innovative therapeutic strategy.Since it is important to better control the infection, we propose here to develop a new strategy, in addition to antibiotic therapy, which aims to limit the ability of P. aeruginosa to survive within macrophages. This approach is based on the MgtC target and a natural MgtR inhibitor.We have tested for the first time the effect of MgtR synthetic peptide on P. aeruginosa. MgtR reduces bacterial survival in macrophages, through its action on the MgtC protein, thus validating the biological effect of the synthetic peptide. This antivirulence strategy is combined with a structural approach, to characterize the MgtC/MgtR interaction from a molecular point of view and to study the effect of MgtR on MgtC dimerization. This could ultimately lead to optimize the MgtR peptide in order to test it in an animal model (preliminary studies in the embryo of zebrafish were inconclusive).In addition, I contributed in a study to characterize the bacterial factors involved in the intramacrophage stage of P. aeruginosa. This work revealed the involvement of MgtC and OprF in the expression of the T3SS, itself responsible for a lysis of macrophages by intracellular bacteria. The use of oprF mutant as an "indicator" of the intramacrophage role in vivo, allowed us to show the importance of bactericidal action of macrophage (e.g. phagosomal acidification) in the control of P. aeruginosa infection, both in cultured macrophages and in zebrafish embryo. This vertebrate model is relevant for the study of P. aeruginosa infection, but also for the involvement of CFTR. cftr-/- embryos appear to be highly susceptible to P. aeruginosa infection, and this model could determine the specific contribution of CFTR to the bactericidal action of macrophage.In conclusion, a better understanding of the intramacrophage stage of P. aeruginosa and the bacterial factors involved, may provide a better control of P. aeruginosa infection