Strategies employed by Pseudomonas aeruginosa to withstand the innate immune system in human whole blood

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est une bactérie à Gram négatif considérée comme pathogène opportuniste, principalement retrouvée chez les patients immunodéprimés ou atteint de mucoviscidose. Cette cause majeure d'infections nosocomiales est à l'origine de pathologies pulmonaires et urinaires, mais est également fréquemment isolée à partir du sang de patients atteints de bactériémies. Les infections sanguines causées par ce pathogène ont été montrées comme particulièrement mortelles par rapport aux septicémies associées à d'autres espèces bactériennes. Une fois entré dans la circulation, Pa doit faire face au système immunitaire inné du sang, cependant les stratégies employées par ce pathogène afin de résister au système du complément et aux cellules phagocytaires n'ont jamais été étudiées dans le sang total. Grâce à l'étude de la survie d'une collection de six souches de Pa dans le sang total humain, nous avons pu démontrer que plutôt que la cytotoxicité envers les leucocytes circulants, la résistance à la lyse par le complément est le principal moteur de la survie bactérienne. De plus, l'origine, le sérotype de l'isolat, ainsi que la nature des toxines exprimées par les différentes souches n'impactent pas leur survie dans cet environnement. Nous avons également découvert que les bactéries sensibles au complément étaient capables d'éviter une éradication totale, grâce à la formation d'une sous-population d'‘‘evaders'' résistante à l'action lytique du complément. Suivant la souche étudiée, cette population représente entre 0,0001 et 0,01% de la population initiale. Ces cellules rares présentent un phénotype transitoire proche des persisteurs, et ont également été observées chez Acinetobacter baumannii, Burkholderia multivorans, enteroaggregative Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Yersinia enterocolitica. La formation d'‘‘evaders'' représente probablement une stratégie efficace permettant aux souches sensibles au complément de persister dans le sang et ainsi disséminer dans l'organisme. Grâce au criblage d'une banque de mutants de transposition en plasma humain (Tn-Seq), nous avons pu identifier de nouveau facteurs bactériens impliqués dans l'interaction entre Pa et le système du complément. Nous avons observé que des bactéries incapables de synthétiser leurs biotine et purines survivent mieux en plasma par rapport à la souche parentale. Egalement, le Tn-Seq nous a permis d'identifier un opéron de trois gènes, que nous avons nommé ‘'srg'' pour ‘'serum resistant genes'', dont les produits sont prédits comme étant localisés à la membrane. La surexpression des protéines SrgABC confère à la bactérie une survie accrue en plasma (augmentation d'un facteur 1000 par rapport à la souche sauvage), et induit une surproduction des alginates chez cette dernière, suggérant l'existence d'une interaction complexe entre la membrane bactérienne, la sécrétion d'exopolysacharides et l'action lytique du complément.Pseudomonas aeruginosa (Pa) is a Gram-negative opportunistic pathogen primarily affecting immunocompromised and cystic fibrosis patients. In addition to lung and urinary tract infections, Pa is often isolated from blood of bacteremic patients. Blood stream infections caused by this particular pathogen register with higher mortality rates compared to septicemia associated with other bacteria. Once in the circulation, Pa faces the innate immune system of the blood, however the strategies employed by this pathogen to escape killing by the complement system and circulating phagocytes have not been investigated in whole blood. In this work, we assessed the survival of a collection of six Pa strains in human whole blood. We found that rather than cytotoxicity toward circulating leukocytes, complement resistance is the main driver of survival in the blood. The origin, serotype of the isolate, as well as the nature of the toxins expressed by the strains did not affect their survival. We also discovered that complement-sensitive strains prevent their eradication through the generation of a minor subpopulation of ‘'evaders'', able to withstand complement-mediated lysis. Depending on the strain, between 0.0001 and 0.01% of the initial population survived in human plasma. The characterization of evaders showed that they harbor a transient persister-like phenotype, and are also observed in Acinetobacter baumannii, Burkholderia multivorans, enteroaggregative Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Yersinia enterocolitica. Formation of evaders likely represent an efficient strategy for complement-sensitive bacteria to persist within the blood and disseminate through the host. Using a genome-wide screen of a transposon mutant library in human plasma (Tn-Seq), we identified new bacterial factors influencing the interplay between Pa and the complement system. We observed that bacteria negatively affected in de novo biotin and purine synthesis survive better in plasma than the parental strain. In addition, Tn-Seq identified an operon of three genes, that we named ‘'srg'' for ‘'serum resistant genes'' whose products are predicted to be membrane bound. SrgABC overexpression confers tolerance to plasma (1000 fold-increased survival compared to wt) and triggers an overproduction of alginates by the bacteria, suggesting complex interplay between bacterial membrane, exopolysaccharides and complement-mediated lysis