Novel Transaminases for the Preparation of Pharmaceutically Relevant Chiral Amines

Chiral amines represent high-value fine chemicals serving as key intermediate products in pharmaceutical, chemical and agrochemical industries. In the past decades, application of amine transaminases (ATAs) for stereoselective amination of prochiral ketones emerged to an environmentally benign and economically attractive alternative to transition metal-catalyzed asymmetric synthesis to afford optically pure amines at industrial scale. However, the restricted substrate scope of wild-type transaminases prohibited the conversion of particularly sterically demanding substrates, making protein engineering indispensable. The following thesis covers elaboration of a novel assay for transaminases (Article I) and identification and development of transaminase variants in order to achieve biocatalytic preparation of a set of pharmaceutically relevant model amines, ideally in optically pure form for both stereoisomers, preferentially using asymmetric synthesis and most preferably using isopropylamine as cost-efficient amine donor co-substrate (Article II-IV). The aforementioned target amines and the corresponding precursor ketones (see Scheme 4.1) were conceived and provided by the company F. Hoffmann-La Roche to attain suitable biocatalysts for a variety of potential intermediates for active pharmaceutical ingredients. Protein engineering of the transaminase scaffolds investigated in this thesis comprised: Initial screening for suitable starting enzyme scaffolds, structure-guided rational design of these scaffolds to enable bulky planar substrate acceptance, elaboration of a sequence motif, verification of the motif and preparative-scale asymmetric synthesis reactions (Article II). For non-planar and structurally different target substrates, namely spatially bulky or bi-cyclic bridged substrates, the transaminase variants were specifically refined and a different evolutionary route had to be pursued (Article III and Article IV). These results (Article II) represent not only the first successful endeavor to engineer a PLP-fold type I amine transaminase (commonly denoted as (S)-selective) for the conversion of highly sterically demanding substrates, but also generally expanded the scope of available fold type I amine transaminases by enzymes having a novel and exceptionally broad substrate spectrum. Aside from structure-guided rational protein engineering, as well non-rational methods, such as site-specific saturation mutagenesis or directed evolution, were applied for protein-engineering. In order to do so for all of the target compounds, a novel high-throughput solid phase activity assay for transaminases that was actually developed during the master thesis, was refined and published (Article I). In the context of this thesis, the same assay principle was as well adapted for quantification of specific activities in liquid phase (Article III). A comparison of different methodologies for developing agar plate assays and a detailed step by step protocol of our transaminase assay are illustrated in a book chapter.Chirale Amine sind sehr wertvolle Feinchemikalien, die in der chemisch-pharmazeutischen Industrie als zentrale Zwischenprodukte benötigt werden. In den vergangenen Jahrzenten, entwickelte sich die Anwendung von Amintransaminasen (ATA) zur stereoselektiven Aminierung prochiraler Ketone zu einer umweltfreundlichen und ökonomisch attraktiven Alternative zur Übergangsmetall katalysierten asymmetrischen Synthese, um chirale Amine auch im industriellen Maßstab herzustellen. Allerdings verhindert das natürliche Substratspektrum von Wildtyp-Transaminasen die Umsetzung von insbesondere sterisch anspruchsvollen Substraten. Daher ist es unausweichlich Protein Engineering Methoden einzusetzen um das Substratspektrum zu erweitern. Die vorliegende Arbeit umfasst die Ausarbeitung eines neuen Assays für Transaminasen (Artikel I) sowie die Identifizierung und Weiterentwicklung von Transaminasevarianten, die es ermöglichen ein Set von pharmazeutisch relevanten Modellaminen biokatalytisch herzustellen, idealerweise in optisch reiner Form beider möglichen Enantiomere, vorzugsweise durch asymmetrische Synthese, sowie idealerweise mit Verwendung von Isopropylamin als kostengünstiges Co-substrat (Artikel I – IV). Die oben genannten Zielamine, sowie deren entsprechende Vorläuferketone (siehe Scheme 4.1) wurden von der Firma Hoffmann-La Roche konzipiert und zur Verfügung gestellt mit dem Ziel schließlich geeignete Biokatalysatoren zur Synthese einer ganzen Bandbreite von strukturell verschiedenen potentiellen Wirkstoffvorläufern zu gewinnen. Protein Engineering der Transaminasen, die in dieser Arbeit untersucht wurden, umfasste: Initiales Screening nach geeigneten Startenzymen, strukturbasierte rationale Mutagenese der Enzyme für die sterisch anspruchsvollen planaren Zielsubstrate, Ausarbeitung eines Sequenzmotifs, Validierung des Motifs und Durchführung von preparativen asymmetrische Synthesen (Artikel II). Für die nicht planaren und strukturell sehr unterschiedlichen Zielverbindungen, nämlich dreidimensional sterische, sowie bi-zyklische Substrate wurden die Transaminasen spezifisch weiterentwickelt (Artikel III und IV). Diese Ergebnisse (Artikel II) stellen nicht nur das erste erfolgreiche Vorhaben dar Transaminasen der PLP-Faltungsklasse I (, die im Allgemeinen als S-selektive Transmainasen bezeichnet werden), zu entwickeln sterisch sehr anspruchsvolle Substrate umzusetzen, sondern erweiterten auch den Umfang der zur Verfügung stehenden Faltungsklasse I Transaminasen um weitere Transaminasen mit einem ganz neuen und außergewöhnlich breitem Substratspektrum. Abgesehen von rationalem Protein Engineering wurden auch non-rationale Methoden angewandt, wie beispielsweise Sättigungsmutagenesen oder gerichtete Evolution. Um dies auch für alle Zielverbindungen umsetzen zu können, wurde ein neuer Hochdurchsatzassay für Agar Platten, der eigentlich während der Masterarbeit entwickelt wurde, weiterentwickelt und publiziert (Artikel I). In dieser vorliegenden Arbeit wurde das gleiche Assayprinzip angewandt und angepasst, um spezifische Aktivitäten im Flüssigphasenassay zu bestimmen (Artikel III). Eine Zusammenstellung verschiedener Methoden zu Entwicklung von Agar Platten Assays, sowie ein detailliertes step-by-step Protokoll unseres Assays für Transaminasen wurde in einem Buchkapitel veröffentlicht