Molecular characterization of segmented & non segmented RNA viruses exemplary for orthobunya- and lyssaviruses

In this study the potential of molecular RT-PCR based methods for diagnostic or epidemiological investigations concerning negative-sense RNA viruses should be demonstrated exemplary for orthobunyaviruses (segmented genome) and lyssaviruses (non segmented genome). The recent discovery of a novel orthobunyavirus from the Simbu serogroup, Schmallenberg virus (SBV), via next generation sequencing and metagenome analysis led to the development of novel molecular detection methods. Due to the potential emergence of further orthobunyaviruses from the Simbu serogroup, a generic pan-Simbu real-time RT-PCR system was developed. This system was able to detect all tested Simbu serogroup viruses. As additional feature a species classification via sequencing is possible. Moreover, the novel pan-Simbu real-time RT-PCR system seems to offer a broad detection spectrum for orthobunyaviruses in general. Hence, this protocol allows a broad screening of samples predominantly for Simbu serogroup virus genomes but also might allow the identification of some related orthobunyaviruses in mammalian or insect samples. A comparison of the pan-Simbu real-time RT-PCR system with diagnostic real-time RT-PCRs revealed an overall higher sensitivity of the diagnostic assays for SBV detection. The diagnostic SBV-S3 assay convinced with the highest sensitivity and reliability for SBV detection. Additionally, the SBV-M1 assay turned out as highly specific for SBV and therefore is a valuable tool for a precise diagnosis in geographical regions where multiple orthobunyaviruses are endemic. Furthermore, the SBV genome diversity in Germany was investigated using a molecular epidemiological approach. Genome variability was extremely high in the N-terminal region of the putative envelope glycoprotein Gc which might have an impact on immunogenicity or host-cell infection. Phylogenetic analyses indicated that sequence variation is independent of host species and geographical distribution. In contrast to SBV as a novel pathogen, rabies encephalitis (caused by the prototype lyssavirus Rabies virus) is known for more than 4000 years. Thus numerous molecular techniques have been developed for lyssavirus detection, considering the diversity of this genus they all have certain limitations as regards their diagnostic range. Results of a lyssavirus ring trial among European laboratories indicate that RT-PCR could be a highly reliable diagnostic tool if at least two independent tests with broad diagnostic range are applied. Another approach suggested that a change from two-step to one-step PCR strategy or a variation of the RT-chemistry may have a remarkable influence on assay performance. However, no ultimate approach or strategy has been found yet, that would facilitate rabies routine diagnosis or epidemiological surveys on molecular grounds. Thus, there is a need for a potent, reliable and practical system for lyssavirus diagnosis and characterization, suitable as a second diagnostic line next to classical techniques like the fluorescent antibody test. For this purpose a diagnostic two level cascade protocol was developed with emphasis on the most relevant European lyssaviruses. On a first level two independent generic pan-lyssavirus screening assays, targeting different genomic regions, were applied. On a second level two probe-based species-specific multiplex PCR systems for the rapid classification of European lyssaviruses were used. All applied assays displayed an overall highly sensitive and specific detection with an excellent reproducibility and repeatability. Moreover, the diagnostic cascade protocol combines all known advantages of the real-time PCR technology including speed and reduced risk of cross-contamination with improved safety of molecular testing based on a double-check strategy for the screening as well as the confirmatory assays. In the frame of the second Bokeloh bat lyssavirus case in a German bat, the capability of real-time PCR for the quantification of viral loads was demonstrated. Another convenient example for the potential of molecular RT-PCR based methods is the epidemiological investigation of the rabies epizootic in Namibian kudu antelopes. Phylogenetic analyses of a 602 bp fragment of the nucleoprotein gene indicated a separate grouping of the Rabies virus (RABV) isolates from kudu apart from RABV isolates from jackals. Full genome sequencing revealed unique mutations in the glycoprotein gene of RABV isolates from kudu, suggesting an independent rabies cycle in Namibian kudu antelopes. All given examples were used to illustrate the application spectrum of molecular RT-PCR based methods for diagnostic or epidemiological purposes. The advantages of molecular techniques were emphasized and in particular real-time RT-PCR systems proved their fitness for purpose and appear to represent standard techniques for the next decade.In dieser Arbeit soll das Potential molekularer RT-PCR basierter Methoden für diagnostische oder epidemiologische Untersuchungen von negativ-Strang RNA Viren am Beispiel von Orthobunyaviren und Lyssaviren aufgezeigt werden. Die Entdeckung des Schmallenberg-Virus (SBV), eines neuen Orthobunyaviruses der Simbu-Serogruppe, mittels next generation sequencing und Metagenom-Analyse führte zur Entwicklung neuer molekularer Nachweismethoden. Auf Grund des möglichen Auftretens weiterer Orthobunyaviren der Simbu-Serogruppe wurde ein generisches pan-Simbu real-time RT-PCR System entwickelt. Dieses System war in der Lage alle getesteten Viren der Simbu-Serogruppe zu detektieren. Darüber hinaus scheint das neue pan-Simbu real-time RT-PCR System ein breites Detektionsspektrum für Orthobunyaviren allgemein aufzuweisen. Somit erlaubt dieses Protokoll ein breites Screening von Proben in erster Linie nach dem Genom von Viren der Simbu-Serogruppe, es kann aber auch die Identifizierung von verwandten Orthobunyaviren in Säuger- oder Insektenproben ermöglichen. Ein Vergleich des pan-Simbu real-time RT-PCR Systems mit diagnostischen real-time RT-PCRs zeigte eine allgemein höhere Sensitivität der diagnostischen Systeme für den SBV Nachweis. Das diagnostische SBV-S3 System überzeugte mit der höchsten Sensitivität und Zuverlässigkeit bei der Detektion von SBV. Als Ergänzung dazu erwies sich das SBV-M1 System als hoch spezifisch für SBV und stellt somit ein wertvolles Instrument für eine präzise Diagnose in Regionen in denen verschiedene Orthobunyaviren endemisch sind dar. Weiterhin wurde mit Hilfe eines molekular epidemiologischen Ansatzes die Genom Diversität von SBV in Deutschland untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Genomvariabilität im N-terminalen Bereich des putativen Hüllglycoproteins Gc extrem hoch war, was einen Einfluss auf die Immuno-genität oder die Wirtszellinfektion haben könnte. Phylogenetische Analysen lassen darauf schließen, dass die Sequenzvariationen unabhängig von der Wirtsspezies und der geo-grafischen Verbreitung auftreten. Im Gegensatz zu SBV als neuem Pathogen ist die Tollwut seit mehr als 4000 Jahren bekannt. Seither wurden zahlreiche molekulare Methoden zum Nachweis von Lyssaviren entwickelt. In Anbetracht der hohen Diversität dieser Virus Gattung weisen alle diese Methoden gewisse Limitierungen in Bezug auf ihre diagnostische Breite auf. Die Ergebnisse eines in europäischen Laboren durchgeführten Ringversuchs sprechen dafür, dass RT-PCR ein sehr zuverlässiges diagnostisches Instrument sein kann, wenn zwei oder mehr unabhängige Tests mit breitem diagnostischem Spektrum benutzt werden. Ein weiterer Versuch wies darauf hin, dass ein Wechsel von einer two-step zu einer one-step PCR Strategie oder eine Variation der RT-Chemie einen deutlichen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit eines Systems haben kann. Dennoch existiert noch keine ultimative Strategie, die eine Tollwut Routine Diagnostik oder epidemiologische Untersuchungen auf molekularer Basis ermöglicht. Daher bedarf es eines leistungsstarken, zuverlässigen und praktischen Systems zur Lyssavirus Diagnose und Charakterisierung, welches parallel zu klassischen Techniken wie dem fluorescent antibody test eingesetzt werden kann. Zu diesem Zweck wurde ein diagnostisches zwei-Stufen Kaskadenprotokoll entworfen. In der ersten Stufe wurden zwei unabhängige generische pan-Lyssavirus Screening Systeme eingesetzt, die unterschiedliche Regionen des viralen Genoms erkennen. Zwei Sonden basierte Spezies spezifische multiplex PCR Systeme für eine schnelle Klassifizierung europäischer Lyssaviren wurden in der zweiten Stufe genutzt. Alle verwendeten Systeme zeigten generell eine hohe Sensitivität und Spezifität sowie eine ausgezeichnete Vergleichbarkeit und Wiederholbarkeit. Darüber hinaus vereint das diagnostische Kaskadenprotokoll alle bekannten Vorteile der real-time PCR Technologie, darunter Schnelligkeit und ein verringertes Risiko von Kreuzkontaminationen, mit einer erhöhten Sicherheit für molekulare Testverfahren basierend auf einer double-check Strategie sowohl für die Screening als auch für die konfirmatorischen Systeme. Im Rahmen des zweiten Bokeloh bat lyssavirus Falles in einer Fledermaus in Deutschland konnte die Anwendbarkeit der real-time PCR zur Bestimmung der Viruslast gezeigt werden. Ein weiteres passendes Beispiel für die Anwendungsmöglichkeiten von molekularen RT-PCR basierten Methoden stellt die epidemiologische Untersuchung der Tollwut Epizootie in Kudu Antilopen in Namibia dar. Phylogenetische Analysen eines 602 bp großen Fragments des Nucleoprotein Gens zeigten eine separate Gruppierung von Rabies Virus (RABV) Isolaten aus Kudus gegenüber RABV Isolaten von Schakalen. Eine Gesamtgenom Sequenzierung enthüllte einzigartige Mutationen im Glycoprotein Gen von RABV Isolaten aus Kudus. Diese Entdeckungen lassen auf einen separaten Tollwut Infektionskreislauf in namibischen Kudu Antilopen schließen