Host range and spillover infections of rodent- and insectivore-borne hantaviruses

Hantaviruses (family Bunyaviridae) are enveloped viruses with a segmented RNA genome of negative polarity. They can cause two different diseases in humans, the hemorrhagic fever with renal syndrome in Europe and Asia and the hantavirus cardiopulmonary syndrome in America. The transmission to humans is mainly indirect by inhalation of aerosolized virus-contaminated rodent excreta. In contrast to the initial assumption that hantaviruses are mainly carried by rodents, during the last years many novel hantaviruses were detected in shrews, moles and recently in bats. These findings raise important questions about the evolutionary history of hantaviruses, their host association and adaptation, the role and frequency of spillover infections and host switch events. This study aims to prove the presence, geographical distribution and host association of the rodent-borne Tula virus (TULV) and the shrew-associated Seewis virus (SWSV) in Central Europe. For this purpose, novel laboratory techniques for molecular and serological hantavirus detection were developed. Initially, a broad-spectrum molecular assay to identify small mammal species from Central Europe was developed. This novel assay is based on PCR amplification using degenerated primers targeting the cytochrome b (cyt b) gene, nucleotide sequence analysis of the amplified cyt b gene portion and followed by pairwise sequence comparison to published sequences using the BLAST function of GenBank. Different small mammal species prevalent in Central Europe could be determined by this new approach, including not only representatives of various Rodentia and Soricomorpha, but also representatives of the orders Erinaceomorpha, Lagomorpha, Carnivora and Chiroptera. For characterization of insectivore-borne hantavirus Thottapalayam virus (TPMV), specific monoclonal antibodies were generated that detect native virus in infected mammalian cells. For the detection of TPMV-specific antibodies, Asian house shrew Suncus murinus immunoglobulin G (IgG)-specific antibodies were produced in laboratory mice and rabbit. Using this anti-shrew IgG and recombinant TPMV nucleocapsid (N) protein, an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed allowing the detection of TPMV N protein-specific antibodies in immunized and experimentally TPMV infected shrews. A Pan-Hantavirus SYBR-Green RT-qPCR was developed for the search to novel hantaviruses. By this novel RT-qPCR and other conventional RT-PCR approaches, TULV infections were identified for the first time in the Eurasian water vole Arvicola amphibius from different regions in Germany and Switzerland. The phylogenetic analyses of the different partial TULV small (S)-, medium (M)- and large (L)-genome segment sequences from A. amphibius, with those of Microtus arvalis- and M. agrestis-derived TULV lineages, revealed a geographical, but host-independent clustering and may suggest multiple TULV spillover or a potential host switch from M. arvalis or M. agrestis to A. amphibius. In a further comprehensive study, different shrew species (Sorex araneus, S. minutus, S. coronatus, and S. alpinus) were collected in Germany, Czech Republic, and Slovakia and screened by another L-segment-targeting Pan-Hantavirus RT-PCR approach. This screening revealed hantavirus L-segment sequences in a large number of S. araneus and a few S. minutus indicating a broad geographical distribution of this hantavirus. For detailed analyses, S-segment sequences were obtained, from S. araneus and S. minutus. The sequences demonstrated their similarity to SWSV sequences from Hungary, Finland, Austria and Germany. A detailed phylogenetic analysis showed low intra-cluster sequence variability, but high inter-cluster divergence suggesting a long-term SWSV evolution in local shrew populations. In conclusion, the investigations demonstrated a broad geographical distribution and multiple spillover infections of rodent-borne TULV and shrew-borne SWSV in Europe. The finding of putative spillover transmissions described here and in other studies underline the current problem of the hantavirus reservoir host definition. In contrast to the hypothesis of a long-standing hantavirus–rodent (small mammal) host coevolution, the investigations support a more dynamic evolutionary history of hantavirus diversification including spillover infections and host-switch events. In future in vitro and in vivo infection studies as well as field studies has to define factors determining the host specificity of these hantaviruses.Hantaviren (Familie Bunyaviridae) sind behüllte Viren mit einem segmentierten RNA Genom negativer Polarität. Sie können im Menschen zwei unterschiedliche Krankheiten auslösen, das hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrom in Europa und Asien und das hantavirale kardiopulmonale Syndrom in Amerika. Die Übertragung auf den Menschen erfolgt meist indirekt durch das Einatmen von Virus kontaminierten, aerosolierten Nagetierexkrementen. Im Gegensatz zu der anfänglichen Annahme, dass Hantaviren hauptsächlich in Nagetieren vorkommen, wurden in den letzten Jahren viele neue Hantaviren in Spitzmäusen, Maulwürfen und erst kürzlich in Fledermäusen entdeckt. Diese Funde werfen wichtige Fragen über die evolutionäre Vergangenheit von Hantaviren, ihre Wirtsassoziation und Wirtsadaptation, die Rolle und Häufigkeit von Spillover-Infektionen und Wirtswechselereignissen auf. Das Ziel dieser Studie war es, das Vorkommen, die geographische Verbreitung und die Wirtsassoziation des Nagetier-assoziierten Tula virus (TULV) und des Spitzmaus-assoziierten Seewis virus (SWSV) in Zentraleuropa zu überprüfen. Zu Beginn wurde ein molekulares Breitspektrumverfahren für die Identifizierung von Kleinsäugerarten aus Zentraleuropa entwickelt. Diese neue Methode basiert auf einer PCR Amplifikation mittels degenerierter Primer, die im Cytochrome B (Cyt B) Gen binden, einer Nukleotidsequenzanalyse des amplifizierten Cyt B Genabschnitts und anschließendem paarweisen Sequenzvergleich mit publizierten Sequenzen mittels des BLAST-Programms in GenBank. Nicht nur verschiedene Kleinsäugerarten der Ordnungen Rodentia und Soricomorpha aus Zentraleuropa konnten mit dieser neuen Methode bestimmt werden, sondern auch Vertreter der Säugetierordnungen Erinaceomorpha, Lagomorpha, Carnivora und Chiroptera. Für die Charakterisierung des Insektenfresser-assozierten Hantavirus Thottapalayamvirus (TPMV) wurden spezifische monoklonale Antikörper generiert, mit denen es möglich ist, natives Virus in infizierten Säugerzellen nachweisen zu können. Für den TPMV-spezifischen Antikörpernachweis wurden Moschusspitzmaus (Suncus murinus) Immunglobulin G (IgG)-spezifische Antikörper in Labormäusen und Kanninchen produziert. Mittels dieser Anti-Spitzmaus IgG und einem rekombianten TPMV Nukleokapsid (N)-Protein wurde ein indirekter Enzymimmunoassay (EIA) entwickelt, der den Nachweis von TPMV N-Protein-spezifischen Antikörpern in immunisierten und experimentell TPMV infizierten Spitzmäusen ermöglicht. Ein Pan-Hantavirus RT-qPCR-Test, welcher auf SYBR-Green als Nachweisreagenz basiert, wurde für die Suche nach neuen Hantaviren entwickelt. Mittels dieser neuen RT-qPCR und anderen konventionellen RT-PCR Verfahren konnten erstmals TULV Infektionen in der Ostschermaus (Arvicola amphibius) aus verschiedenen Regionen in Deutschland und der Schweiz identifiziert werden. Die phylogenetischen Analysen der verschiedenen partiellen TULV S-(small), M-(medium) and L-(large)Genomsegmentsequenzen aus A. amphibius, mit in Microtus arvalis und M. agrestis gefundenen TULV Linien, zeigten eine geographische, jedoch wirts-unabhängige Clusterung und könnten auf multiple TULV Spillover oder einen potentiellen Wirtswechsel von M. arvalis oder M. agrestis zu A. amphibius hindeuten. In einer weiteren umfangreichen Studie wurden verschiedene Spitzmausarten (Sorex araneus, S. minutus, S. coronatus und S. alpinus) in Deutschland, der Tschechischen Republik und der Slowakei gesammelt und mit einem anderen L-Segment-spezifischen Pan-Hantavirus RT-PCR Verfahren getestet. Dieses Screening führte zu der Identifizierung von Hantavirus L-Segment Sequenzen in einer großen Anzahl von S. araneus und in einigen wenigen S. minutus, was auf eine breite geographische Verbreitung dieses Hantavirus hindeutet. Für weitere detailliertere Analysen wurden S-Segment Sequenzen aus S. araneus und S. minutus generiert. Die Sequenzen zeigten Ähnlichkeiten zu SWSV Sequenzen aus Ungarn, Finnland, Österreich und Deutschland. Eine detaillierte Phylogenetische Analyse konnte niedrige Intra-Cluster Sequenzvariabilitäten, aber hohe Inter-Cluster Divergenzen aufzeigen, was auf eine langandauernde SWSV Evolution in lokalen Spitzmauspopulationen hindeutet. Die Untersuchungen konnten eine weite geographische Verbreitung und multiple Spillover-Infektionen des Nagetier-assoziierten TULV und des Spitzmaus-assoziierten SWSV in Europa aufzeigen. Die hier und in anderen Studien gefundenen möglichen Spillover-Transmissionen verdeutlichen das gegenwärtige Problem der Hantavirus-Wirtsdefinition. Im Gegensatz zu der Hypothese einer langandauernden Hantavirus-Nagetier-(Kleinsäuger)-Wirtsevolution unterstützen diese Untersuchungen eine dynamischere, evolutionäre Geschichte der Hantavirusdiversifikation, mit Spillover-Infektionen und Wirtswechselereignissen. In Zukunft sollten in vitro und in vivo Infektionsstudien und auch Feldstudien Faktoren für die Wirtsspezifität dieser Hantaviren definieren