Membranas biológicas : propriedades biofísicas e função das aquaporinas

Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014Membranes are barriers that assure the selective communication of the internal media with the external environment, a process that is crucial for life. Membrane components, lipids and proteins, are the main players responsible for the membrane selective permeability and its regulation. The work presented in this thesis encompasses different aspects of biological membranes features. The first part of this thesis is dedicated to the study of the influence of dietary lipids in membrane biophysical properties, namely fluidity and permeability. We used animal models and designed experiments where the effect of the diet supplementation with fatty acids, PUFA and the conjugated linoleic acid (CLA) on membrane composition, fluidity and permeability, were analysed. In addition, since the animal genetic background is known to have an important contribution to the regulation of several biochemical pathways and resulting in different phenotypes, this variable was included in the study. Within the same animal species all adipose membranes were found richer in SFA independently of their genetic background or diet. The lipid adipose membrane composition of Zucker rats is highly dependent on the lipid composition of the diet. Regarding the adipose membrane biophysical properties, we were able to correlate a decrease in membrane fluidity and the concomitant decrease on permeability to water and glycerol with the incorporation of t10,c12 CLA isomer into adipose membranes of Zucker rats. Interestingly, this CLA isomer is the one with suggested fat lowering properties in several animal studies. The animal genetic background in obese pigs was also found to play a determinant role on the fluidity of adipose membranes, in accordance with the reported for a wide variety of cell membranes from obese mice and rats. Interestingly, the same increase in membrane fluidity was observed for pigs fed a low protein diet and was correlated with the ratio oleic /linoleic acid. A similar effect was consistently reported in adipose membranes of genetically obese mice pointing to a clear compensatory mechanism to maintain membrane biophysical properties. The second part of this thesis is dedicated to the study of membrane protein channels, aquaporins, aiming at identifying new modulators with potential pharmacological use. Furthermore, building an experimental cell model able to characterize individual aquaporin activity and selectivity as well as to validate modulators’ effect and potency was another goal of this work. Using the human erythrocyte that expresses one orthodox aquaporin (AQP1) and one aquaglyceroporin (AQP3), we reported on the potent and selective inhibition of human AQP3 by a water-soluble gold(III) coordination compound, Auphen. From molecular modelling studies and docking approaches, we were able to propose a mechanism of action of Auphen for human AQP3 inhibition, where Cys40 is the crucial residue for binding. Inhibitory assays with other metal complexes, namely phenantroline derivatives of Pt(II) and Cu(II), showed that the AQP3 inhibition potency decreased drastically in the order Au(III) > Cu(II) >> Pt(II). Interestingly, no inhibition effect was achieved when incubating the cells with gold(I) compounds, therefore, demonstrating the necessity of gold(III)-based scaffolds to achieve protein binding and blockage of the channel. Our mechanistic hypothesis was based on the possibility for Auphen and analogues to bind to certain amino acid residues in the channel close to the selectivity filter domains, thus acting as a “cork” preventing the passage of glycerol. Given the diversity of pathologies associated with dysfunction of the different aquaporins, these proteins are now emergent drug targets. However, cells and tissues frequently express more than one aquaporin isoform in the plasma membrane and unless a specific isoform is mutated or overexpressed, its function is not easily discriminated. To overcome this difficulty, we developed a yeast heterologous system for expression and functional assessment of aquaporin isoforms. Such a cell system expressing individual AQPs would also be very useful for analysis of function and regulation of aquaporins from the plant kingdom. Plants express numerous aquaporin isoforms, but for most their physiological relevance is still unclear. Using this approach, grapevine aquaporins VvPIPs, VvTIPs and VvSIPs were expressed in yeast and functionally analysed. We demonstrated that only some isoforms are functional while others are not, and they may transport other small molecules of physiological importance such as ammonia, boron, CO2, hydrogen peroxide and urea. In particular for VvSIP1, we disclosed for the first time its ability to transport water but not glycerol, urea, sorbitol, glucose, or inositol.As membranas biológicas comportam-se como barreiras que asseguram a comunicação seletiva do meio interno com o ambiente externo, um processo que é crucial à vida. Os componentes membranares, lípidos e proteínas, são os principais responsáveis pela permeabilidade seletiva das membranas e sua regulação. O estudo apresentado nesta tese abrange diferentes aspetos característicos das membranas biológicas. A primeira parte desta tese foi dedicada ao estudo da influência dos lípidos da dieta nas propriedades biofísicas das membranas, em particular fluidez e permeabilidade. Foram utilizados modelos animais e concebidos ensaios experimentais onde se analisou o efeito da suplementação da dieta em ácidos gordos, PUFA e ácido linoleico conjugado CLA, na composição lipídica, fluidez e permeabilidade das membranas do tecido adiposo. Ainda, uma vez que a herança genética tem uma contribuição importante para a regulação de vários processos metabólicos resultando em fenótipos diversos, esta variável também foi incluída neste estudo. Na mesma espécie animal, as membranas de tecido adiposo são mais ricas em ácidos gordos saturados independentemente da sua raça ou dieta. A composição lipídica das membranas de tecido adiposo de ratos Zucker é muito dependente da composição lipídica da dieta. Relativamente às propriedades biofísicas, foi possível correlacionar um decréscimo da fluidez da membrana e concomitante decréscimo da permeabilidade à água e ao glicerol com a incorporação do isómero de CLA t10,c12 nas membranas do tecido adiposo de ratos Zucker. Curiosamente, em diversos estudos animais têm sido atribuídas propriedades de emagrecimento a este isómero CLA. A herança genética (raça) também tem um papel importante na fluidez das membranas do tecido adiposo, em concordância com o já descrito em vários estudos em membranas celulares de ratinhos e ratos obesos. Também se verificou um aumento da fluidez membranar em porcos alimentados com restrição proteica, o que foi correlacionado com a razão dos ácidos oleico/ linoleico. Um efeito semelhante foi já reportado para membranas de tecido adiposo de ratinhos geneticamente obesos, apontando para um mecanismo compensatório que leva à manutenção das propriedades biofísicas das membranas. A segunda parte desta tese foi dedicada ao estudo de canais proteicos membranares, as aquaporinas, com o objetivo de identificar novos moduladores com potencial utilização farmacológica. Ainda, pretendemos desenvolver um modelo experimental para a caracterização individual da atividade e seletividade de aquaporinas e para a validação do efeito e da potência de moduladores. Utilizando eritrócitos humanos que expressam uma aquaporina ortodoxa (AQP1) e uma aquagliceroporina (AQP3), descrevemos a forte inibição seletiva da AQP3 por um composto de coordenação de ouro(III) hidrossolúvel, o Auphen. Através de estudos de modelação molecular e de docking, foi possível propor um mecanismo de ação do Auphen para a inibição da AQP3 onde o resíduo de cisteína cys40 é crucial para a ligação. Os ensaios de inibição com outros complexos metálicos, nomeadamente derivados da fenantrolina de Pt(II) e de Cu(II), revelaram que a inibição decresce drasticamente na ordem Au(III) > Cu(II) >> Pt(II). Curiosamente, não se observou inibição quando as células foram incubadas com compostos de gold(I), demonstrando assim a importância dos esqueletos dos compostos de gold(III) para a ligação à proteína e bloqueio do canal. Assim, a nossa hipótese de mecanismo é baseada na possibilidade do Auphen e análogos se ligarem a certos resíduos de aminoácidos no canal, perto do filtro de seletividade, atuando deste modo “como uma rolha” que impede a passagem do glicerol. Devido á diversidade de patologias relacionadas com a disfunção de diferentes aquaporinas, estas proteínas são atualmente consideradas alvos terapêuticos. Contudo, na membrana plasmática das células e tecidos é frequentemente expressa mais do que uma isoforma de aquaporina, pelo que a sua função não é facilmente discriminada a não ser que essa isoforma específica seja mutada ou sobre-expressa. Para ultrapassar esta dificuldade, foi desenvolvido um sistema de expressão heteróloga em leveduras para a expressão e análise funcional de aquaporinas. Tal sistema também é muito útil para a análise da função e regulação de aquaporinas do reino vegetal. As plantas expressam numerosas isoformas de aquaporinas mas na maior parte dos casos, a sua relevância fisiológica ainda não foi estabelecida. Utilizando esta abordagem, as aquaporinas de uva VvPIPs, VvTIPs e VvSIPs foram expressas em leveduras e a sua função foi analisada. Foi demonstrado que somente algumas isoformas são funcionais, e que algumas podem estar envolvidas no transporte de outras moléculas com importância fisiológica tais como amónia, boro, CO2, peróxido de hidrogénio e ureia. Em particular para a VvSIP1, foi pela primeira vez revelada a sua capacidade para transportar água mas não glicerol, ureia, sorbitol, glucose ou inositol.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT