Efecto del glicerol sobre la catálisis por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama pacos)

Objective: To determine the effect of glycerol on hydrolisis of p-nitrophenyl phosphate at pH 5,0 by low molecular weight acid phosphatase from alpaca liver. Design: Experimental analytical study. Setting: Biochemistry and Nutrition Research Center, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru. Materials: Disodic p-nitrophenyl phosphate salt, glacial acetic acid, glycerol, tricloroacetic acid, sulfuric acid, ammonium molibdate, ascorbic acid, ammonium sulphate, sephadex G-75 (45-120), sulpho ethyl sephadex C-50 and ethylene diaminotetraacetic (EDTA) chemical reactives. Methods: Both Km and Vmax kinetic parameters were determined with p-nitrophenyl phosphate as substrate in presence of different concentrations of glycerol. The rate of formation of products was determined as a function of the concentration of such nucleophile. Main outcome measures: Glycerol effect on p-nitrophenyl phosphate hydrolysis. Results: Glycerol linearly increased pnitrophenol release at concentrations between 1,16 and 3,49M. Instead, inorganic phosphate formation, the second product, was not modified. Also, Km and Vmax values increased linearly between 0,58 and 2,32 M depending on glycerol concentrations. Conclusions: Analysis of modifications induced by glycerol on Km and Vmax values as well as on liberation velocity of the reaction products suggests a model in which low molecular weight acid phosphatase isolated from alpaca liver catalyses phosphomonoesters hydrolysis through an uni biordered mechanism, with formation of an enzyme-phosphate complex that will be splitted by water or a nucleophile such a glycerol; in this model, k2 corresponds to a much higher value than k3 or k4 N.Objetivo: Determinar el efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato a pH 5,0 por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca. Diseño: Estudio analítico experimental. Lugar: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Materiales: Se utilizó los reactivos químicos p-nitrofenil fosfato sal disódica, ácido acético glacial, glicerol, ácido tricloroacético, ácido sulfúrico, molibdato de amonio, ácido ascórbico, sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-120), sulfoetil sephadex C-50 y etilendiaminotetraacético (EDTA). Métodos: Se determinó los parámetros cinéticos Km y Vmax utilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato, en presencia de concentraciones variables de glicerol. Así mismo, se determinó la velocidad de liberación de los productos de la reacción en función de la concentración de dicho nucleófilo. Principales medidas de resultados: Efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato. Resultados: El glicerol en concentraciones comprendidas entre 1,16 y 3,49 M incrementó linealmente la liberación del p-nitrofenol; en cambio, la formación del fosfato inorgánico -el segundo producto liberado- no se modificó. Así mismo, los valores de Km y Vmax se incrementaron linealmente dependientes de las concentraciones de glicerol, en un rango comprendido entre 0,58 y 2,32 M. Conclusiones: Un análisis de las modificaciones que ejerce el glicerol sobre los valores de Km y Vmax y la velocidad de liberación de los productos de la reacción permite sugerir un modelo en el que la fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca cataliza la hidrólisis de fosfomonoésteres a través de un mecanismo uni biordenado, con la formación de un complejo enzima-fosfato, que sería escindido por agua o un nucleófilo, como el glicerol; en este modelo a k2 le corresponde un valor mucho mayor que k3 y k4 N