Optimization of a gellan gum support by experimental design for recombinant proteins partition

Chromatography is one of the most studied methods, due to its simplicity, versatility and high reproducibility, to separate and purify molecules that can have therapeutic, industrial and biotechnological interest. In recent years, the development of new chromatographic matrices has been continuously increased in order to afford rapid and efficient separations and decrease the use of resources. Gellan gum is a natural anionic exopolysaccharide and, in the presence of divalent cations, has the ability to form thermos-reversible strong gels resistant to temperature and extreme acidic conditions. In this work, it was proposed the preparation of gellan gum microbeads to be used as a stable chromatographic stationary phase. In order to produce the matrix, a low-cost water-in-oil emulsion technique was adopted. To obtain optimal conditions to the bead formulation, experimental design was applied, which allowed the optimization of the experimental conditions and to produce microbeads with the smallest diameter possible. Due to the negative charge of gellan gum, it was possible to study the interactions established with three model proteins (BSA, a-chymotrypsin and lysozyme) and with a therapeutic complex protein, SCOMT. In the model protein assays, MES buffer with pH 6.2 was used, which conferred negative charge to BSA and positive charge to a-chymotrypsin and lysozyme, due to its isoelectric points. Thus, BSA did not bind to the matrix while the other two proteins were retained to the gellan gum, being eluted with an increase of ionic strength. Regarding to prepurified SCOMT sample, a buffer with pH 4.0 was used under equilibrium conditions, conferring positive charge to the protein, thus, it also interacted with the column and was majorly eluted by pH manipulation (by changing the buffer pH to 6.4), allowing the elimination of some protein contaminants. Dynamic binding capacity assay of the gellan gum microbeads was made, in order to characterize this support as a novel chromatographic matrix. The values of DBC of the gellan gum stationary phase to 10 % and 50 % of breakthrough were 2.43 mg/mL and 4.73 mg/mL, respectively. These DBC values are satisfactory when compared to commercial resins used in affinity chromatography, taking into account that protein interaction only occurred at the gellan bead surface. These results indicated that gellan gum microbeads obtained by waterin- oil emulsion technique can be used as an innovative and promising chromatographic support due to its gelling ability and versatility to interact with different biomolecules.A cromatografia é um dos métodos mais usados para a separação e purificação de diferentes biomoléculas terapêuticas. É uma técnica que tem sido muito explorada, ao longo dos últimos anos, nas áreas da indústria farmacêutica e biotecnológica para a obtenção de proteínas e ácidos nucleicos com elevado grau de pureza. Os suportes cromatográficos têm sido alvo de grandes desenvolvimentos a fim de encontrar uma matriz que reúna as características ideais como porosidade, estabilidade química e física, elevada eficiência de transferência de massa, baixo custo de produção associado, biocompatibilidade, hidrofilicidade, boa capacidade de manutenção do fluxo e capacidade de reutilização após vários ensaios cromatográficos. A goma de gelana é um polímero polissacárido natural linear que tem uma vasta gama de aplicações em diversas áreas, desde a indústria alimentar (agente espessante e gelificante), cosmética (loções, cremes, maquilhagem, etc), indústria biotecnológica (como um substituinte do agar), indústria farmacêutica (sistema de entrega direcionada de fármacos e microencapsulações) e medicina (construção de “scaffolds” para regeneração de tecidos). Devido às suas propriedades como versatilidade, biocompatibilidade, biodegradabilidade e elevada estabilidade, a gelana tem atraído grande interesse por parte do mercado e tem ganho crescente importância entre as diferentes indústrias. A gelana possui a capacidade de, em determinadas condições e na presença de catiões divalentes, sofrer uma alteração conformacional formando uma forte rede tridimensional devido às interações entre a gelana, os iões e as moléculas de água dando origem a um gel termoreversível, resistente a altas temperaturas e a extremas condições ácidas. Tendo em conta as características apresentadas, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a formulação de uma matriz cromatográfica pela técnica de emulsão água-em-óleo a fim de ser usada em diversos processos cromatográficos. A inovação deste projeto tem como base a produção de microesferas através de um método de emulsão água-em-óleo, usando dois líquidos imiscíveis, a água e um óleo alimentar vegetal. Trata-se de uma técnica que não requer o uso de instrumentos complexos, é de fácil manuseamento, tem baixo custo associado e permite o fácil controlo dos parâmetros associados a este processo. A preparação das esferas foi feita de acordo com os seguintes parâmetros: concentração da goma de gelana (1 % - 2,5 %), velocidade de agitação (250 rpm – 750 rpm) e temperatura (20 ºC – 100 ºC). Considerando que todos estes fatores afetam a estabilidade e estrutura das microesferas, foram feitas várias formulações utilizando um desenho experimental, estratégia que permitiu obter as condições ótimas no sentido de se produzirem micropartículas com o mínimo diâmetro possível. As condições ótimas fornecidas pelo desenho foram 1,41 % de concentração de gelana, 749,47 rpm de velocidade de agitação e 99,20 ºC para obter microesferas com um tamanho de 277,08 µm. Para a formulação deste suporte cromatográfico, foi necessário a presença de catiões divalentes numa solução de reforço, para onde as esferas foram transferidas a fim de aumentar a estabilidade. O catião escolhido foi o bário, que devido ao seu grande tamanho iónico é considerado bastante eficaz na gelificação da gelana, pois contribui largamente para a formação da estável e rígida rede tridimensional. Além disso, o bário também permitiu a formação de esferas uniformes de tamanho reduzido com um pequeno ratio de inchaço. Para a validação do modelo fornecido pelo software do desenho experimental, foi necessário efetuar cinco réplicas de dois pontos previstos dados pelo programa. A visualização das esferas produzidas foi feita através de microscopia ótica que permitiu a medição dos diâmetros das micropartículas e através de microscopia eletrónica de varrimento, que tornou possível a análise estrutural das esferas num estado liofilizado, bem como a análise topográfica e morfológica da sua superfície. Além disso, esta última metodologia também permitiu avaliar a porosidade das esferas, de onde foi constatado a ausência de canais interiores, sugerindo que qualquer interação estabelecida com a matriz de goma de gelana se dê apenas na sua superfície. Aproveitando a natureza aniónica do polímero de gelana e o facto de não ter que ser funcionalizada com ligandos como os suportes cromatográficos comerciais, foi possível explorar diferentes interações com as proteínas modelo albumina sérica bovina (BSA), a-quimotripsina e lisozima, bem como com um extracto parcialmente purificado da proteína catecol-O-metiltransferase humana na isoforma solúvel (hSCOMT). Nos ensaios com as proteínas modelo, o tampão usado foi o MES a pH 6.2, o que conferiu carga negativa à BSA e cargas positivas à a-quimotripsina e lisozima devido aos seus pontos isoelétricos. Assim, a BSA não ligou à matriz tendo sido eluída após a injeção da amostra na coluna, ainda com a passagem do tampão sem sal, enquanto as outras duas proteínas interagiram devido à oposição de cargas, tendo sido eluídas com o aumento da força iónica. Quanto à amostra pré-purificada de SCOMT, foi usado um tampão de pH 4.0 nas condições de equilíbrio, o que conferiu carga positiva a esta proteína. Esta condição permitiu a interação desta proteina com a coluna, tendo sido maioritariamente eluída através da manipulação do pH (alterando o pH do tampão para 6.4), permitindo assim a eliminação de algumas proteínas contaminantes presentes na amostra. A fim de se caracterizar melhor esta nova matriz cromatográfica, foi determinada a capacidade dinâmica de ligação utilizando uma estratégia de saturação da coluna com uma solução de lisozima 0,5 mg/mL a 1 mL/min. Os valores obtidos na capacidade de ligação das microesferas de goma de gelana a 10 % e 50 % da curva de saturação foram 2,43 mg/mL e 4,73 mg/mL, respetivamente. Comparando com outras matrizes cromatográficas comerciais e tendo em conta que apenas a área de superfície das microesferas de gelana é funcional, estes valores estão dentro do esperado. Estes estudos permitiram concluir que a estabilidade da matriz cromatográfica de gelana foi incrementada com o desenvolvimento deste projecto de mestrado e que permitiu a interação com proteínas de várias naturezas, através de estratégias de eluição com manipulação de força iónica e pH. Em suma, os dados apresentados manifestam uma versatilidade da gelana em interagir com diferentes biomoléculas e, devido à sua capacidade de gelificação, foi possível a elaboração deste inovador e promissor suporte cromatográfico para a cromatografia de troca catiónica, a partir de microesferas da goma de gelana