Rat BCRP의 Cloning과 이를 발현하는 MDCK cell line의 구축

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과, 2015. 2. 정석재.약물이 체내에서 특정 조직으로 이동할 때 많은 수송체가 관여하는데, 수송체가 약물을 얼마나 조직세포로 잘 흡수하는지, 또는 조직세포 밖으로 내보내는지에 따라 약물의 체내 분포가 달라진다. 이런 중요성을 인식하여 미국 FDA는 여러 약물 수송체 중 약물 상호작용에 주로 관여하는 7가지 수송체를 선정하고, 신약개발 중 신약 후보물질이 약물 수송체와 관련한 약물상호작용을 발생시키는지 검토하도록 권고하였다. 신약개발 단계에서는 인간을 대상으로 약의 유효성, 안전성을 평가하기 전에 실험동물에 약물을 투여하여 체내 분포, 대사, 배설이 어떻게 진행되는지 알아보는 in vivo 실험을 반드시 거쳐야 하며 이 실험 결과를 바탕으로 신약 후보물질을 결정하게 된다. 이 때 인간의 약물 수송에 관여하는 수송체는 기질 특이성, affinity 등의 측면에서 실험동물의 수송체와 다르다. 실험동물로 in vivo 실험을 하는 것은 궁극적으로 인간에서 나타날 결과를 미리 예측해보기 위함인데, 종간 차이에 대해 예측하지 못한다면 실험동물에서의 약물 체내동태 결과를 신뢰하기 힘들다. 따라서 실험동물과 인간에게 나타나는 약물동태 결과의 괴리를 극복하기 위하여 약물 수송체의 종차를 정확하게 이해하는 것이 매우 중요하다. 따라서 본 실험에서는 FDA 선정 7가지 수송체 중 하나인 BCRP에 해당하는 rat에서의 abcg2를 cloning 하기로 하였다. Rat abcg2가 많이 발현 된 rat liver total RNA로부터 Reverse transcription과 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 통해 abcg2 gene을 증폭시켰다. 그리고 PCR을 통해 얻은 abcg2 DNA를 T-vector와 ligation 시킨 뒤 pcDNA3.1/myc-His(-) vector 내로 subcloning 하였다. 완성된 clone을 MDCKⅡ cell에 stable 하게 transfection 시켰다. 이후 2~3주간 geneticin으로 selection 과정을 거친 후 RT-PCR 반응을 진행하여 rat BCRP DNA가 mRNA 단계에서 존재함을 확인할 수 있었다. 이 in-vitro system이 기능적으로도 잘 발현됨이 검증된다면 신약후보물질에 대한 약물 수송계 수준의 약물상호작용 가능성을 개발 초기단계에서 예측할 수 있으며 궁극적으로 신약개발 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대 된다.국문초록 ......................................................................................................ⅰ 목 차 ............................................................................................................ⅲ 표 목차 ........................................................................................................ⅴ 그림 목차 ....................................................................................................ⅴ 1. Introduction ..........................................................................1 1.1. 약물 수송체 (Drug transporter) ...............................................1 1.2. Breast cancer resistance protein (BCRP) ...............................1 1.3. 약물 상호작용 (Drug-drug interactions) ................................3 1.4. In-vitro screening system ..........................................................3 2. Materials ................................................................................5 3. Methods...................................................................................7 3.1. Reverse transcription (RT) ........................................................7 3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) ..........................................8 3.3. Gel extraction ................................................................................9 3.4. Ligation ...........................................................................................9 3.5. Transformation ............................................................................10 3.6. Liquid culture .............................................................................11 3.7. Miniprep .......................................................................................12 3.8. Sequencing ...................................................................................12 3.9. Subcloning ....................................................................................12 3.10. Mutagenesis ...............................................................................14 3.11. Transfection ...............................................................................15 3.12. RT-PCR .......................................................................................16 4. Results .................................................................................17 5. Discussion ...........................................................................20 6. Reference .............................................................................23 Abstract ....................................................................................26Maste